Оздоровление растений

1 Многие полезные растения настолько инфицированы вирусными, бактериальными и грибными болезнями, что это приводит ежегодно к резкому снижению урожая и ухудшению качества продукции. Клональное микроразмножение растений, осуществляемое стерильными эксплантами в асептических условиях, приводит к оздоровлению от бактериальных и грибных патогенов, однако от вирусной инфекции поверхностной стерилизацией материала освободиться нельзя.

Бороться с вирусными болезнями привычными химическими методами невозможно, так как жизнедеятельность вирусов тесно связана с метаболизмом клетки-растения-хозяина. Фитопатогенные вирусы, которых сейчас описано более 600, не опасны для человека, но, поражая все культурные растения, они наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Например, потери урожая от вирусных заболеваний картофеля составляет 25-88 %, у винограда – до 60 %, у вишни – до 35-96 %, у сливы – 5-95%, у яблони – 66%. Причем продуктивность и качество урожая могут снижаться и без внешних симптомов заболевания, что в конце концов приводит к вырождению сорта. Так, ценный сорт картофеля Бель-де-Фонтенэ во Франции практически исчез в результате заражения вирусом и был возрожден из здоровой меристемы, выделенной из зараженного растения и культивируемой in vitro.

Основной путь борьбы с вирусными болезнями – получение здорового посадочного материала. В последнее время для получения безвирусных растений картофеля и многих других вегетативно размножаемых культур успешно применяется метод культуры апикальных меристем в сочетании с термообработкой, хемотерапией и тестированием на наличие вирусов.

Метод культуры апикальных меристем принципиально отличается от традиционных методов очистки растений от вирусов, потому что при культивировании здоровых растений-регенерантов в стерильных условиях исключается опасность повторной инфекции. Основанием для использования апексов с целью получения здоровых растений послужили эксперименты П.Лимассе и П.Корнуе. Они в 1949 году установили, что концентрация вирусов табачной мозаики в листьях табака снижалась по мере приближения к верхушке. У половины верхушек побегов, или апикальных меристем, вирус не был обнаружен. Применение метода апикальной меристемы на практике для оздоровления вегетативно размножаемых культур от вирусных болезней началось благодаря работам Г.Мореля и К.Мартина в 1952 году. Они использовали этом метод для оздоровления георгина от вируса мозаики.

Нет единого мнения о причинах слабой репродукции вирусов в меристемных тканях. Одни исследователи объясняют отсутствие вирусов в меристеме более медленным их распространением от клетки к клетке из-за того, что в верхушечной меристеме нет проводящей системы, а передвижение вирусов от клетки к клетке затруднено из-за слишком малого размера плазмодесм. Другие пытаются объяснить этот факт особым метаболизмом меристематических клеток, ингибирующим синтез вирусного нуклеопротеида.

При тепловой обработке размножение вирусов в развивающейся верхушке побегов так сильно тормозится, что при дифференциации меристемы возможно появление клеток, свободных от вирусов. Для успеха тепловой обработки необходимо выдерживать донорные растения при высокой температуре (34-40 ^оС) в оптимальном для роста состоянии как можно дольше, чтобы получить прирост, свободный от вирусов. Однако не все растения выдерживают длительную тепловую обработку, что приводит к отставанию в росте и другим нарушениям у меристемных растений. У полевых и плодоовощных культур оздоровление проводится при комплексном применении термообработки, культуры меристемы и отбора на основе вирусных тестов.

2 Поскольку не всегда удается получать безвирусный материал тепловой обработкой и культурой меристемы, важное место в этой работе принадлежит эффективному тестированию. Применяются разные методы оценки на наличие вирусов: растения-индикаторы, серологические методы, электронно-микроскопический и иммуноферментный анализ.

В основе метода растений-индикаторов лежит способность растений отдельных видов отвечать специфической реакцией при нанесении на них сока из тканей больного растения. Это трудоемкий и длительный метод. Требуются специальные растения, условия и площади для их выращивания. Кроме того, чувствительность метода зависит от многих факторов, ответная реакция проявляется через длительное время. Одним словом, этот метод диагностики не го-дится для быстрой и эффективной оценки на наличие вирусов при массовых обследованиях в промышленных масштабах.

То же самое можно сказать и в отношении трудоемкого и дорогостоящего электронно-микроскопического метода, который используется при фундаментальных исследованиях, например при контроле во время препаративного выделения вирусов, при первичной идентификации новых вирусных заболеваний.

В сельскохозяйственной практике обычно применяются серологические методы, основанные на реакции антигенов с антителами вне организма. При капельном методе серодиагностики капля неочищенного сока растения смешивается с каплей антисыворотки на предметном стекле. Вирусные частицы, адсорбированные на клеточных органоидах, вовлекают их в серологическую реакцию, образуя заметный агглютинат. Однако этот метод обладает слабой чувствительностью и может применяться только для выявления вирусов, накапливающихся в листьях в высокой концентрации. Даже в этом случае метод ограничен тестированием вирусов только в листьях взрослых растений, тогда как эффективная система оздоровления растений предполагает диагностирование именно миниатюрных растеньиц-регенерантов, полученных из апикальной меристемы, так называемых мериклонов. В них вирусы присутствуют в концентрациях, лежащих за пределами чувствительности серологического метода.

Наиболее чувствительным методом тестирования является метод иммуноферментного анализа в различных вариантах. Помимо высокой чувствительности и быстроты анализа, преимуществом метода является то, что для индикации требуется минимальное количество растительного материала из любых органов растений. Однако повсеместное применение метода у нас ограничивается недостатком иммунодиагностических наборов для обнаружения различных вирусов. В настоящее время разработан неиммунологический метод диагностики вирусов на основе применения молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Этот метод в будущем, видимо, заменит иммуноферментный метод диагностики вирусов.

Широкое внедрение системы безвирусного растениеводства в практику предполагает тестирование на зараженность разными вирусами миллионов растений различных культур, для этого требуется не только экспресс-методы диагностики, но и автоматические приборы для их проведения.

3 Технология производства безвирусного картофеля начинается с термообработки клубней. По общепринятой гипотезе размножение вирусов при температуре 34-40 ^оС тормозится вследствие перестройки обмена веществ. Тепловая обработка может длиться от 7 дней до 7 недель в зависимости от типа вируса. Клубни также обрабатываются ингибиторами вирусов и стимуляторами роста растений. Для вычленения меристем используют этиолированные или светло-зеленые ростки длиной 3-5 см. После поверхностной стерилизации и промывки ростков в стерильном боксе из них вычленяют верхушечные меристемы. Изоляция меристем размером 50-100 мкм практически невозможна, поэтому вместе с ней изолируют первые листовые примордии и тогда ее размеры достигают 500 и более мкм. Из-за этого снижается надежность получения безвирусного экспланта, но зато повышается степень его дифференциации.

Апексы, помещенные на агаризованную питательную среду, развиваются и образуют проростки длиной 0,3-0,5 см. Затем их пересаживают на свежую питательную среду для стимуляции корнеобразования и роста стебля. После появления 5-7 листьев эти растеньица расчеренковывают и каждый черенок сажают в пробирку с питательной средой того же состава. Один черенок используют для проверки на наличие вирусов. Здоровые растения становятся родоначальниками безвирусных линий. Ускорение размножения здоровых линий достигается методом последовательного микрочеренкования. Растения из черенков развиваются значительно быстрее, чем из меристемы, дают более сильную корневую систему и большее количество листьев. Метод черенкования растений в пробирках позволяет получить до 2-3 тысяч растений за 2-3 месяца.

Далее эти миниатюрные растеньица (суперсуперэлита) либо депонируются, либо пересаживаются в почву теплиц. Надо отметить, что этот этап работы очень важный и требует большого внимания. В благоприятных условиях для оздоровления сорта в среднем достаточно вычленить 40 меристем и можно in vitro за 7-8 месяцев от них получить 30-40 тыс. клубней. Эффективность оздоровления в большей мере зависит от сортовых особенностей, исходной зараженности вирусами, сезонных влияний и т.д. Растения, размноженные в изолированных условиях – в теплице, являются суперэлитой и размножаются затем в суперэлитных маточниках. Полученные элитные растения размножаются в производственных питомниках, и полученные от них клубни (семенной материал) передаются в хозяйства для промышленного производства оздоровленного посадочного материала. Нужно учесть, что через 5-6 лет сорт вновь заражается и требуется новый, оздоровленный посадочный материал.

В целях более эффективного использования меристемных растений разработана технология ускоренного размножения картофеля микроклубнями.

Растения черенкуют, и черенки высаживают на среду, способствующую образованию клубней. Для стимуляции их образования растения подвергают воздействию низких температур (10-15 ^оС). При этом микроклубни зачастую образуются в пазухах листьев.

Микроклубни лучше хранятся и очень удобны для последующего размножения, тогда как высаживание в грунт пробирочных растений сопровождается потерями.

В последнее время пытаются для оздоровления картофеля использовать каллусную ткань. В процессе пассирования каллуса происходит освобождение его клеток от вирусов, и в результате спонтанного или индуцированного морфогенеза получаются здоровые растения-регенеранты, и даже доказано, что для некоторых сортов метод каллусных культур более эффективен, чем метод апикальных меристем. Более активный морфогенез наблюдается в каллусе, полученном из верхних частей растений.

Степень успеха в получении свободного от вирусов материала зависит от следующих предпосылок: 1) возможность термической обработки материала; 2) возможность культуры меристемы; 3) наличие отработанного теста с высокой точностью выявления вирусов; 4) высокий коэффициент размножения здорового растения; 5) организация размножения оздоровленного исходного материала в условиях полной изоляции, чтобы избежать повторного заражения; 6) объем культуры, который позволит обеспечить возможность ежегодного обновления исходного материала. Эти предпосылки неодинаково выполнимы у различных культур. В настоящее время этим методом оздоровлены почти все ценные сорта картофеля, но, к сожалению, у нас в стране он слишком медленно внедряется в практику первичного семеноводства.

Криоконсервация меристемы (хранение в жидком азоте при температуре минус 196 ^оС) позволяет при малых затратах труда, средств и производственной площади содержать большую коллекцию генофонда в свободном от инфекции состоянии с сохранением генетической стабильности исходного материала. Повышение продуктивности растениеводства, которого можно добиться, используя здоровый посадочный материал, должно стать основой для создания промышленной биотехнологии по оздоровлению растений.

Получение свободного от фитопатогенной инфекции посадочного материала разработано для целого ряда овощных и кормовых, плодово-ягодных, декоративных и древесных культур. Так, во Франции культура меристемы используется для оздоровления георгинов, гвоздик, орхидей. В Венгрии в промышленных масштабах получают безвирусную рассаду овощных, плодовых и ягодных культур. Оздоровленный посадочный материал картофеля используется во Франции, Чехословакии, Болгарии, Италии, Дании, Нидерландах, США, Канаде и в других странах. Урожай картофеля при этом увеличивается на 20-50 %.

В лаборатории вирусологии и биотехнологических методов оздоровления плодово-ягодных культур Института плодоводства и виноградарства Казахстана (В.А. Долгих) разработаны технологии производства безвирусного посадочного материала. Выявлен широкий спектр вирусов у земляники, малины, смородины, ежевики, винограда, яблони, груши, вишни, сливы и др. В результате этих работ налажено производство безвирусного посадочного материала для многих хозяйств основных плодовых зон.

Таким образом, основной путь борьбы с вирусными болезнями – это получение in vitro здорового посадочного материала. Для получения безвирусных растений применяется культура апикальной меристемы, в которой вирус почти не обнаруживается. Если же растение – донор апекса подвергнуть тепловой обработке (34-40 ^оС), то размножение вируса в развивающейся верхушке побега тормозится так сильно, что растущий апекс становится свободным от вируса. Регенерант, выросший in vitro из такого изолированного апекса, будет безвирусным. Полученное растение клонируют микрочеренкованием. Важное место в этой работе принадлежит диагностике зараженных растений. Наиболее чувствительным методом тестирования является иммуноферментный анализ, для которого требуется минимальное количество материала из любого органа растения. Технология получения безвирусного посадочного материала разработана для целого ряда овощных и кормовых, плодово-ягодных, декоративных и древесных растений.