Гаплоидная технология 3

1Работы по культивированию женских репродуктивных органов с целью получения гаплоидных растений начались еще в 50-е годы, и в последние годы интерес к культуре женского гаметофита особенно возрос. Это, во-первых, обусловлено тем, что культивирование неоплодотворенных семяпочек мужских стерильных растений является единственной возможностью получения у них гаплоидов. У мужских стерильных линий табака и сахарной свеклы эти методом получены гаплоидные растения. Во-вторых, женский гаметофит может быть источником получения гаплоидов у тех растений, у которых каллусная ткань обладает низким морфогенетическим потенциалом либо регенерирует растения-альбиносы. У некоторых растений в культуре семяпочек частота регенерации зеленых растений значительно выше, чем из пыльников. Например, у ячменя все гаплоидные растения, индуцированные через гиногенез, оказались хлорофиллоносными, в то время как при андрогенезе 99 % растений-регенерантов были альбиносами.

Индуцирование гаплоидов в культуре семяпочки называется гиногенезом и является одной из форм апомиксиса. Апомиксис – это размножение организмов, не сопровождающееся половым процессом. В зависимости от того, дает начало новому организму половая или вегетативная клетка, различают две основные формы апомиксиса партеногенез и апогамию.

Партеногенез – это форма полового размножения организмов, при которой женские половые клетки (яйцеклетки, яйца) развиваются без оплодотворения. Партеногенез – половое, но однополое размножение, потомство повторяет генотип матери. Зародыш может быть как гаплоидный, так и диплоидный. Апогамия (апогаметия) – гаметы не образуются, а зародыш (гаплоидный или диплоидный) развивается из синергиды или антиподы.

2 Женский гаметофит растений – зародышевый мешок располагается в семяпочке и окружен нуцеллусом и интегументами (покровами), образующими при смыкании узкий канал – микропиле, противоположная микропиле часть семяпочки называется халазой (рис.12). Халазной стороной семяпочка через семяножку прикрепляется к плаценте.

Семяпочки цветковых растений образуются в завязи. Типичный зародышевый мешок, так называемый нормальный тип, развивается из одной мегаспоры, дифференцирующейся в нуцеллусе семяпочки, которая разрастаясь, трижды делится и превращается в 7-клеточное 8-ядерное тело с упорядоченным расположение клеток.

Зародышевый мешок состоит из крупной яйцеклетки и прилегающих к ней двух менее развитых вспомогательных клеток – синергид. Ближе к центру располагается двуядерная центральная клетка, у халазального полюса – три одинаковые клетки – антиподы. В нормальном типе зародышевого мешка ядра всех клеток, за исключением центральной, гаплоидные. Центральная клетка содержит два гаплоидных ядра, которые затем сливаются и образуют диплоидное ядро. В результате двойного оплодотворения из яйцеклетки образуется диплоидная зигота, дающая начало зародышу, а из центральной клетки развивается триплоидный эндосперм.

Зародышевый мешок в морфологическом и физиологическом отношении представляет собой более сложную структуру, чем пыльцевое зерно. В связи с этим индукция гаплоидных растений в культуре женского гаметофита имеет свои особенности.

В ранних работах по культивированию завязей и семяпочек наблюдалась только пролиферация соматических тканей, окружающих зародышевый мешок. Впервые гаплоидный каллус был получен Тулеком в 1964 г. в культуре женского гаметофита представителя голосеменных растений –гинкго.

Гаплоидный набор хромосом в каллусе свидетельствует о том, что каллус индуцирован из гаплоидных клеток зародышевого мешка. Однако попытки индуцировать органогенез в этом каллусе не увенчались успехом.

Рисунок 12. Поперечный срез семяпочки ортотропного типа

У покрытосеменных гаплоидный каллус был индуцирован японскими исследователями в 1971 г. в культуре неоплодотворенных семяпочек баклажана и в культуре завязи кукурузы. Но они тоже не смогли получить растения-регенеранты. Получить нормальные зеленые гаплоидные в культуре неоплодотворенных завязей ячменя впервые удалось Сан Ноуму в 1976 г. С тех пор проведены многочисленные эксперименты по индуцированию гаплоидных растений в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек различных видов покрытосеменных растений.

Показано, что формирование гаплоидных растений является результатом аномального развития женского гаметофита и осуществляется двумя способами: через эмбриоидогенез и каллусогенез. Как и в культуре пыльников, получение гаплоидных растений в культуре семяпочек предпочтительнее через эмбриоидогенез.

В норме новый организм возникает из зиготы, но явление апомиксиса, наблюдаемое в природе, свидетельствует о том, что начало новому организму может дать и неоплодотворенная яйцеклетка (партеногенез), а также и другие клетки зародышевого мешка (апогамия).

Видимо, при создании в завязи и семяпочке каких-то, пока неизвестных, условий в клетках зародышевого мешка нарушается генетически запрограммированный цикл развития. В результате отдельные клетки выходят из состояния тупиковой дифференцировки и приобретают способность к дальнейшему развитию, образуя апомиктические зародыши. Ценность этих зародышей состоит в том, что они наследуют только признаки материнского растения. По-видимому, такие же процессы протекают в культурах in vitro у изолированных неоплодотворенных завязей и семяпочек.

Гаплоидные эмбриоиды или каллус также могут иметь различное происхождение, то есть возникать сразу из нескольких или только из единственной клетки зародышевого мешка. Развитие эмбриоидов из клеток зародышевого мешка отмечалось у ячменя, риса, пшеницы, кукурузы, сахарной свеклы, табака, гевеи.

Сан Ноум, изучая индукцию гаплоидных растений в культуре неоплодотворенных завязей ячменя, обнаружил, что эмбриоиды образуются различными путями: из яйцеклетки и антипод, из антипод, из яйцеклетки и одной синергиды, из яйцеклетки и двух синергид, из одной или двух синергид, из синергид и антипод, из яйцеклетки и антипод. Он полагает, что гаплоидные эмбриоиды у ячменя формируются преимущественно из антипод, а клетки каллусного типа образуются из синергид.

В культуре неоплодотворенных завязей риса наблюдали индукцию гаплоидного эмбриогенеза и каллусогенеза в основном из синергид, антиподы при этом не изменялись, но затем они несколько раз делились или совсем дегенерировали. У табака в культуре неоплодотворенных семяпочек гаплоидные эмбриоиды возникали в результате деления яйцеклетки, а у скерды – из антипод. Причины или факторы, побуждающие элементы зародышевого мешка in vitro дедиференцироваться или переключаться на незапрограммированный путь дифференцировки, остаются пока не выясненными.

Цитогенетические исследования культивируемых завязей и семяпочек показали, что in vitro индуцируются к пролиферации и клетки соматических тканей, окружающие зародышевый мешок. Из нуцеллуса и интегументов формируются диплоидные и полиплоидные растения. Нуцеллярная эмбриония (развития зародыша из нуцеллуса) часто встречается в природе у цитрусовых и манго. Полиэмбрионию в культуре нуцеллуса удалось индуцировать у несколько видов лимона, а также у винограда.

С.К. Мухамбетжанов в Институте физиологии, генетики и биоинженерии растений НАН РК изучал рост им морфогенез в культуре неоплодотворенных завязей пшеницы. Он показал, что программа морфогенеза реализовалась на основе процессов каллусогенеза, органогенеза и эмбриоидогенеза. Апомиксис у пшеницы in vitro осуществляется на основе «переключения» клеток женского гаметофита на спорофитный путь развития. При этом в клетках зародышевого мешка и окружающих его тканей могут протекать следующие морфогенетические процессы: гиногенез (из яйцеклетки) , апогаметия (из синергид и антипод), адвентивная эмбриония (из клеток нуцеллуса или интегументов).

Таким образом, при культивировании неоплодотворенных завязей и семяпочек не исключена возможность индукции каллуса из диплоидных клеток соматических тканей. Конечно, лучше было бы культивировать непосредственно зародышевый мешок, но вычленить его без повреждения очень трудно. Выделить семяпочку в зависимости от вида растений можно механическим либо ферментативным путем, растворяя окружающие ткани пектиназами. Однако до настоящего времени попытки не увенчались успехом в связи с тем, что выделенный зародышевый мешок характеризуется низкой жизнеспособностью. Возможно, окружающие зародышевый мешок соматические ткани способствуют повышению жизнеспособности зародышевого мешка и даже оказывают положительное влияние на индукцию гаплоидного эмбриоидо-и каллусогенеза.

В связи с вышеизложенным, в некоторых случаях более эффективно получение гаплоидных растений с материнскими свойствами не путем гиногенеза, то есть в культуре семяпочки, а в процессе псевдогамии. Это специфический случай гаплоидного партеногенеза, когда для индукции гаплоидного развития необходимо опыление пыльцой. Вследствие селективной элиминации хромосом дикого ячменя растение-регенерант развивается фактически из яйцеклетки и обладает всеми материнскими признаками. Партеногенетическое развитие яйцеклетки возможно также при опылении пыльцой, обработанной ионизирующим излучением.

3 На процесс индукции гаплоидных растений влияет целый комплекс лимитирующих факторов. Среди них можно выделить факторы эндогенные (генотип исходного растения, степень развития зародышевого мешка) и экзогенные (состав питательной среды, условия культивирования).

При разработке методов получения гаплоидных растений в культуре завязей и семяпочек, как и при культивировании пыльников, необходимо учитывать эффект генотипа донорного растения. Эмпирически подобранные условия получения гаплоидов для одного сорта оказываются непригодными для других и требует существенных модификаций.

Другим фактором, определяющим развитие неоплодотворенных завязей и семяпочек в культуре, является стадия развития женского гаметофита.

Правильный подбор питательных сред является важным фактором. Чаще всего используются среды МС, Миллера, Нича, № 6. Определяющее значение имеет тип и количество фитогормонов. Для одних видов необходимы в определенном сочетании ауксины и цитокинины, очень высокие концентрации фитогормонов в питательной среде в большей степени стимулируют каллусогенез из соматических тканей завязи, чем из гаплоидных элементов зародышевого мешка.

Определенную роль играют витамины, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и другие натуральные экстракты. Существенное значение имеет присутствие в среде углеводов.

Таким образом, при культивировании завязей и семяпочек подбор оптимального уровня компонентов питательной среды, особенно стимулирующих рост веществ, осуществляется эмпирически для каждого конкретного вида и даже сорта растения.

Обычно завязи и семяпочки выращивают поверхностным способом, но в опытах на рисе, хлопчатнике показана возможность их культивировать в жидких средах. Культивирование осуществляют при температуре 23-28 ^оС при освещении или в темноте с подбором оптимального температурного и светового режима для каждого конкретного эксперимента.