Антиденелерді бөліп алу технологиялары

- поликлонды антиденелерді – гипериммунизация жолымен;

- толық көлемді моноклонды антиденелерді – гибридомды технологиямен;

- бір тізбекті, химерлі, гуманизирленген және конъюгирленген моноклонды антиденелерді – рекомбинантты ДНҚ технологиямен.

Гипериммунизация және гибридома технологиялары толық көлемді, екі тізбекті антиденелерді (яғни поли- және моноклонды) алуға мүмкіндік береді. Рекомбинантты ДНҚ технологиялары біртізбекті (химерлі, гуманизирленген, конъюгирленген) антиденелерді өндейді.

Гибридомды технология

Гибридомды технологияның негізгі кезеңдері:

- қажетті антигендермен бір линиядағытышқандарға немесе басқа зертхана жануарларына иммунизация жасау (мысалы, HBs-Ag немесе ЖИТС вирусына СД4 беткейлік нәруызы). Теріасты, іш қуысына немесе тамыр ішіне антигенді енгізуімен қайтара иммунизацияның қысқа- және ұзақ уақытты сызбанұсқалары;

- иммунизацияланған жануарлар көкбауырынан лимфоциттерді бөліп алу (бір спецификасы бар антиденелер синтезіне қабілетті);

- тышқанның миеломды лимфатикалық клеткаларды дайындау (миелома клеткалары – бұл шексіз өсіп-көбейюге қабілетті малигнизирленген В-лимфоциттер);

- клетка мембраналарын (мысалы, ПАГ) біріктіру процесін күшейтетін қосылыстар көмегімен миеломды және көкбауырдың клеткаларын біріктіру (гибридизация);

- гибридомды клондарды өсіру; көкбауырдың клеткаларынан алынған моноклонды антиденелер өндіруші-гибридомдар антиденелер синтездеуге қабілетті, ал миеломды клеткалардан шексіз өсуді қабылдайды;

- қажетті спецификасы бар антиденелерді түзетін гибридомдарды тандау, клондау (серологиялық реакцияларда анықтау);

- гибридомды клеткаларды in vivo-даасцитті сұйықтықта немесе клетка дақылында in vitro-дасақтау;

- моноклонды антиденелерді бөліп алу, концентрлеу және тазарту (тұздармен тұнбалау, аффинді хроматография, гель-фильтрация);

- антиденелердің авидтілігі және аффинділігін талдау, олардың титрін анықтау. Моноклонды антиденелер иммуноглобулиндердің класы және типі, спецификалылығы, авидтілігі және аффинділігі бойынша бірдей.

Дегенмен, тышқан лимфоциттерінен моноклонды антиденелерді алуына негізделген гибридомды технология медициналық практикада қолдануына шектеу салынған. Адам организміне осы антиденелер антиген ретінде бөгделік қасиеті бар, сондықтан терапиялық мақсатта қолдану барысында ажыратылып қалатын иммунды реакция береді, адам организмінде толық қанды эффекторлы қызмет атқара алмайды. Сонымен қатар, басқа жануарлардың басқа клетка дақылдары секілді гибридомдар өсуі бәсендетіліп өтіледі, жоғары клеткалар тығыздығы жоқ және күрделі, қымбат қоректік орталарды талғам етеді.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы

Рекомбинантты антиденелер алу сұраныс мақсаты талап етеді, біріншіден, олардың түрлілігі организмдегі В-лимфоциттер клондары санымен өлшемдейтін антигендердің спецификалық байланысына қарасты және екіншіден, олардың өндірістік өнімі, өнім ретінде модификацияланған микроорганизмдер немесе эукариотты клеткаларды алу.

Әртүрлі спецификасы бар, түрлі вариабельді бөлімдері бар рекомбинантты антиденелерді алу үшін қазіргі уақытта кеңінен E.coli бір жіпті бактериофагтар негізінде конструкцияланған Fv-фрагменттері мен бір жіпті (scFv) антиденелердің жинақталған кітапханалар қолданылады; бұл фагтық дисплей әдісі.

Адамның немесе тышқанның клеткалары (В-лимфоциттер) түзіп жатқан антиденелердің мРНҚ-нан кДНҚ синтездейді (мысалы, гибридомды технологиямен алынған тышқан антиденелерінің CDR бөлігін кодтайды). Н- және L-тізбектер кодтайтын кДНҚ дара ПТР-амплификациясын жүргізеді. Амплифицирленген кДНҚ арнайы рестрицирлейтін эндонуклеазалармен өндейді, кейін бактериофаг негізінде векторды енгізеді. кДНК Н- және L-тізбектері әртүрлі, тек әр қайсысына арналған эндонуклеазалық сайттары бар, сондықтан олардың векторға әр нуклеотидті қатардың арнайы ендірілуін жеңілдетеді. Осы кезеңде Н- және L-тізбектерінің көптеген түрлі сегменттер клонданады. Н- және L-тізбектің Fv-фрагментін кодтайтын кДНҚ векторға, бактериофаг геномына енгізеді.

Кейін in vitro-да рекомбинантты бактериофагтардың ішінен CDR нәруызын экспрессиялайтынын, арнайы антигенмен байланысатынын таңдап іріктейді. 1990 жылдары алғаш рет жіптік фаг қабатының гибридтік нәруыз құрамына бір тізбекті қатардың экспрессиясы жүретіні дәлелденген. Рекомбинантты антиденелер репродуцирленген модификацияланған жіптік бактериофагтарға (әр фаг тек бір антидене нұсқасын алып жүреді) экспонирленеді. Әрі қарай вектор-бактериофагының ДНҚ кодталған гені бар антиденелерді in vitro-да антигенмен байланыса алатын қабілеті барларын іріктейді.

Сонымен, белгілі спецификасы бар рекомбинантты антиденелер дайындауы бактериофагтың нақты санына ендірілген ДНҚ клондар қорын алуымен басталады. Әрі қарай биопаннинг (biopanning) жүреді – иммобилизацияланған лигандаларға (арнайы антигендерге) жоғары аффинділікке қабілетті бактериофагтардың селекциясы. Биопаннинг немесе аффинді селекция арқылы өз беткейінде қажетті спецификасы бар мини-антиденелерді тасымалдайтын бактериофагтар қорын байытуға болады және байытылған популяциядан қажетті қасиеттері бар мини-антиденелер синтезін кодтайтын гендерді тасымалдайтын фагтарды таңдап іріктейді. Фагтық дисплей технологиясымен жарыққа шыққан бір фаг қоры құрамындағы ДНҚ клондар саны сүтқоректілер организміндегі олардың түрлеріне тен әртүрлі спецификасы бар антиденелер синтезін кодтауға қабілетті.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясына кіретін фагтық дисплей әдісін гибридомды технологиямен салыстырғанда олар түзілетін антиденелердің аффинділігін жоғарлатады (антигенмен байланысатын сайттарын жетілдіру). Биопаннингті модификацияланған гендерді қолданып (қателіктер жіберетін полимеразалар немесе ПТР-мутагенезі, немесе антиденелердің гипервариабельді ілмектердің бағытты ПТР-мутагенезін қолдану арқылы) бактериофагтарды іріктеу циклын қайта-қайта үстемелеу арқылы аффинділігін тағы да жоғарлатып аса тиімді байланысатын антиденелер алуға болады.

Мысалы, фагтық дисплей көмегімен альфа-ісіктер некроздау факторы (осы антиденелерді ревматизмге қарсы зат ретінде қолданылады), бетта-өсудің тіндік факторы (офтальмологияда фиброзды аурулар терапиясы үшін) аутоантигендеріне, өспе антигендеріне және т.б. антиденелер бөліп алынған.

Рекомбинантты антиденелер өнімдерін алу мақсатта модификацияланған кДНҚ экспрессия векторына ендіреді де қажетті иесі-клеткасына трансформациялайды (микроорганизмдер, жиі E.coli немесе сүтқоректілер клеткалары).

Толық көлемді рекомбинантты антиденелердің синтезі үшін векторларды сүтқоректілер клеткаларына экспрессиялайды. Тек эукариоттық клеткаларда антиденелердің эффекторлық қызметі дамуы үшін нәруызды молекуланың дұрыс жиналуы және гликолизі жүреді. Сонымен, лимфоидты клеткалардағы химерлі антиденелердің экспрессиясы промоторлар, энхансерлер, транскрипция факторы атты табиғи реттеу жүйесі бақылауында болады. Осындай реттеу жүйелері прокариот клеткаларында кездеспейді. Тандау барысында бөліп алынған рекомбинантты антиденелер түзетін лимфоциттер клонын биореакторларда дақылдандырады.

Заманауи технологияларда қабырғасы жартылай өткізгіштік мембранамен қапталған, бос талшықты биореакторлар іске асырылған. Талшықтар бойында қоректік орталар айналады, олардың компоненттері жартылай өткізгіштік мембрана арқылы негізгі бөлікке түседі, онда дақылданатын клеткалар мен жартылай өткізгіштік мембранадан өте алмайтын синтезделген антиденелер жинақталынады. Осылай дақылдандыру әдістің жетістігі – ақырғы өнімнің концентрациясы жоғары болуда, яғни антиденелердің саны. Жақсы тазартылған нәруыздар – антиденелер алу үшін антиденелер синтездейтін клеткалары бар дақылдық ортаны жинап алып, аффинді, ион алмастыру және гель өтетін хроматография әдісімен тазартады.

Бір тізбекті антиденелерді алу технологиясы

Клондалған моноклонды антиденелердің женіл және ауыр тізбектерінің вариабельді домендерін (VL және VH -домендері) бөлек кодтайтын кДНҚ дәнекерлі немесе линкерлі нәруыз (ол моновалентті, бір тізбекті антиденелердің ауыр және жеңіл тізбектерінің вариабельді домендерін бір-бірімен қосады) кодтайтын химиялық жолмен синтезделген ДНҚ-линкермен қосылады. Құрастырылған гендік конструкция бактериофагқа ендіріледі. Осындай вектордан өндіруші клеткада вирус гені өнімімен, яғни фаг қабатының нәруызымымен қосылған scFv (Fv-фрагмент бөлігі) форматтағы антидене фрагменті экспрессияланады.

Вектор ретінде прокариоттық клеткаға трансфекция жасайтын бактериофагтан басқа плазмидаларды қолданады. Плазмида негізінде жасалған векторлық конструкция құрамына кіреді: промотор, жетекші, CDR ауыр және жеңіл тізбектері және оларды қосып тұратын қозғалмалы линкер және ампицилинге тұрақты ген (немесе басқа антибиотикке), репликация басталу сайты.

Бір тізбекті, мини-антиденелер өндіруші ретінде жиі E.coli қолданады. Ішек таяқшасында түзілетін химерлі ақуыз ерімейтін цитоплазматикалық қосындылар бөледі. Оларды гуанидингидрохлоридте ерітіп алып жылдам ерітінді және анион-алмастырушы хроматография көмегімен (осы жолмен АИВ gp120 рецепторынасәйкестігі (троптылығы) бар Т-лимфоциттердің СД4 ақуызы және псевдомонадалардың А экзотоксин-нәруызы, яғни иммунотоксині алынды) бөліп алады.

Бір тізбекті антиденелердің антигенге туыстығы және спецификасы (авидтілігі мен аффинділігі) интактті, моноклонды антиденелердікіне ұқсас келеді. Мини-антиденелердің аффинділігі жүздегенесе жоғарлауы ПТР-амплификация сатысында кездейсоқ мутациялары кезінде болады және әрі қарай олардың Fv-фрагменттерінің арнайы бөліктерінің тандауы жүреді. Классикалық бір тізбекті мини-антиденелердің дәлелденген жетістіктерімен қоса айтарлықтай кемшіліктері де кездесіп жатады, мысалы антигенге олар моновалентті, ал табиғи антиденелер – еківалентті, яғни байланыстыратын екі орталығы бар. Сондықтан мини-антиденелер байланыстыру константасы бойынша табиғи иммуноглобулиндерге жол береді, нысана-клеткалар бетінде дұрыс жиналмайды және қанайналымынан жылдам шығып кетеді. Толық көлемді моноклонды антиденелерғе қарағанда мини-антиденелер иммунды жүйенің компоненттерін, яғни киллер-клеткалары немесе Т-лимфоциттерді жұмысқа қоса алмайды, себебі оларда осы міндетті атқаратын константты домені жоқ..