Сүтқоректілер клеткаларында экспрессиялайтын рекомбинантты ақуыздары

Өндіруші ретінде сүтқоректік клеткаларын қолданатын рекомбинантты нәруыздар өндірісі екі бағытта жүргізіледі:

- биореакторда in vitro-да жануардың гендік модификацияланған клеткаларын дақылдандыру; - адам нәруыздарын өндіретін трансгенді жануарларды қолдану (жануардың сүт безі – рекомбинантты нәруыздар биореакторы).

Іn vitro-да рекомбинантты нәруыздар биосинтезі:

Іn vitro-дарекомбинантты нәруыздар биосинтезіне тұрақты өндірілетін өндірістік клетка дақылдары – клеткалық бағыттар (стандартты дақылдарға атжалманның CHO және BNK клеткалары және т.б. жатады) қажет. Алғашында мақсатты ген тасымалдайтын векторды клетка дақылдарына трансфекцияланады. Әрі қарай супер өндіруші штамды алу үшін РНҚ-интерференция көмегімен бар клеткалық бағытты нақты модификациялауына ДНҚ амплификация жүргізіледі. Кейін өндірістік жағдайда клеткаларды дақылдандыруына қоректік орталарды тандау және ыңғайлау керек. Өндірістік клеткалық бағытты қалыптастырудың міндетті шарты оның тұрақтылығы, сондықтан клетка дақылдарын суспензия жағдайына ауыстырғанда және өсуін адаптациялауына бірнеше жоғары өндірілген клондар өнімдерінің тұрақтылығына және 100-150 клеткалық екі еселену уақытында пролиферация жүретініне тестілеу жасалынады. Өндірістік өнімдердің барлық талаптарына жауап беретін оптимальды клон негізінде рекомбинантты нәруызді өндіретін клетканың өндірістік бағытын алады. Өндіруші клеткаларды дақылдандыратын зертхана таза бөлмелері үшін GMP регламентіне сәйкес ұйымдастырылады: ауаны конденциирлеу және фильтрлеуінің бөлек вентиляция жүйесі ауаның 10-еселік көлемін қамтамасыз ету керек; клеткалық блоктың ішіндегі қысым басқа бөлмелер қысымына қарағанда жоғары болу тиіс. Осындай зертханалар ламинарлармен, СО₂-инкубатормен, флюоресцентті және сәулелі микроскоптармен, микро- және препараттық центрифугалармен, клеткалардың пролиферациялық активтілігін бағалайтын цитофлюориметрлермен, клеткалық циклды сараптаутын қондырғы және т.б. жабдықталынады. Клеткаларды 5-10 литрлі ферменттерлерде дақылдандырады, кей жағдайларда бір реттік мини-биореакторлар қолданылады (сур.36).

Сурет 36. 50 мл көлемді бірреттік биореактор. Биореактор вентиляцияланатын қақпағында қоршаған атмосферамен газ алмасуы оптимальды өту үшін әртүрлі диаметрлі бес саңылау жасалынған; биореактордың стерильдігін сақтау және булану арқылы сұйықтықтың азаюын тоқтату үшін осы саңылауларда жартылай өткізгіш мембрана орналастырған. Биореактор ішінде ешқандай араластыратын қондырғы немесе механизмдері орнатылмаған, инкубациялық шейкерде тұрақты шайқалу өтеді (онда температураны, көмірсутегі газдың парциалық қысымын және ылғалдылығын, және шайқау жылдамдығы мен амплитудасын реттеуге болады). Шағын көлемді биореакторлар параллельді жүздеген осындай қондырғыларда қажетті рекомбинантты нәруыздарды өндіретін клеткаларды дақылдандыруын жүргізуге жол ашты.

Іn vitro-дажекеленген сүтқоректі клеткалар қолдану технологиясында ақырғы өнімнің құны жоғары болуы; өндіруші клеткалардың өндірісінде кездесетін мутацияларымен байланысты мәселелері бар.

Еx vivo-датрансгенді жануарлар алуының гендік-инженерлік технологиялары:
а) Ұрықтанған жануардың аналық безіне реттеуші элементімен қоса (промотор) клонда-натын ДНҚ микроинъекциясы. Кейін ұрықтанған клетканы суррогатты ана жатырына инокуляцияланады. Жаңа туған жануарды трансфекцияланған генді анықтауына тестіленеді және жыныстық камелетке жеткенде қарапайым жануарлармен бұдандастырады. Дегенмен, ДНҚ микроинъекция әдісінің нәтижелігі төмен: трансгенді ұрықтар 1-5% жағдайда ғана тіршілік ете алатын ұрыққа айналған;

б) Ұрықтанған клетканың ядросын соматикалық клетка ядросымен ауыстыру жолымен клондау. Сонымен, жаңа туған жануар қажетті ген тасымалдаушысы бола алады. Осы технология көмегімен Долли қойы клондалған.

Рекомбинантты нәруыздар өндірушісі трансгенді ешкілер, ірі қара мал, көжектер, тышқандар, үй құстары және т.б. жануарлар бола алады.

Бұл белгілі бір нәруыздың жеткіліксіздігінен туындаған гемофилия, ангионевротикалық ісік, альфа-1 антитрипсин дефициті және басқа ауруларды емдеуіне тағайындалатын препараттар.

Осындай аурулардың емдеуіне қажетті нәруызбен әлемдік қамтамасыз ету үшін 50 сиыр немесе 100 ешкі түлектері қажет. Мысалы, бір трансгенді ешкінің сүтінен алынатын рекомбинантты адамның нәруызы – антитромбин III (фибринолитикалық препарат ретінде қолданылады) өлшемі донор қанының 90 мың дозасына тен келеді (сур.37).

Трансгенді жануарлардың сүті тағам ретінде қолданылмайды. Трансгенді ешкінің сүтінен дәрі алу аса кері қарама-қайшылықтар тудырмады, гендік модификацияланған ауыл шаруашылық дақылдар шыққандағы көз қараспен салыстырғанда. Өсімдіктерден, яғни олардың тозаңдары бөгде гендермен қоса желмен жеңіл тарап кету айрмашылығынан ешкілер кездейсоқ гендік материалдың таралу көзі бола алмайды.

Сурет 37. Трансгенді ешкілер – рекомбинантты нәруыздарды өндірушілер

Генді-модификацияланған бактериялар мен тарнсгенді жануарлар бөгде геннің (трансген) тасымалдаушысы болады. Онда қажетті нәруыздың синтезі немесе жиналуы жүреді, кейін осы протеин бактерия клеткасына немесе клетка аралық кеңістікке (микробтық синтезінде) немесе сүт безінде (өндіруші жануар болғанда) бөлінеді. Әрі қарай сұйықтықтан нәруыз адсорбцияланып тазартылады, ал трансфекцияланған ген бактериялық клетка ішінде немесе жануарлар организмінде қалып қояды. Сонымен, тазартылып алынған өнімде трансген болмайды. өндіруші микроорганизмдер немесе өндіруші жануарлар – нәруыздан генге қарай аралық бөлігі болып келеді.

Гормондар, цитокиндер және басқа биологиялық активті қосыластармен бірге эукариотты құрылымды модифицирленген микроорганизмдер штамдарының клеткалары альбумин, аса мықты биологиялық материалдың және т.б. синтезіне қолданылады:

- эукариотты микроорганизмді қолданып адамның рекомбинантты альбуминнің алу технологиясы. Осылай Pichia pectoris ашытқының жоғары өнімді штамы алынған, кеңінен қолданатын ішек таяқшасы өнімімен салыстырғанда оның өнімі аса жоғары, сондықтан эукариотты рекомбинантты нәруыздар құны тым төмен. Интерлейкин-2 өндіретін Saccharomyces cerevisiae, ашытқының штамы алынды.

- медицина үшін тордың жасанды нәруыздары. Тордың каркастық жібі аса мықты және эластикалы, екі нәруыздан құралған:

спидроин-1 және спидроин-2; осы нәруызды медицинада тігу материалы, жасанды байланыстар мен шеміршектер, жаралар мен күйікті жабуға және жазылуына жұқа үлпек ретінде қолданылады. Спидроин-1 және Pichia pastoris арнайы штамның плазмидалық векторын кодтайтын ген синтезделген. Рекомбинантты микроорганизм спиндроин-1 нәруызын өндіреді. Қалындығы бірнеше микрондағы жібі алынған, мықтылығы сүйек пен шеміршектен жоғары. Спидроин-2 нәруызын кодтайтын ген синтезі бойынша зерттеулер жүргізіліп жатыр (сур.38).

Сурет 38. Жасанды жіптік фотографиясы, ашытқы клеткасынан рекомбинантты нәруызы негізінде - өрмекші өрімдерінің каркасты жіптері нәруызының аналогы алынды (шыны ыдысындағы этанолда).