Рекомбинантты нәруыздар

Терапиялық, рекомбинантты нәруыздар рыногі дүние жүзінде қарқынды өсіп барады, себебі бұрын соң емделмейтін көптеген ауруларда тиімді нәтиже береді, диагностика мен дәстүрлі емдеу әдістерімен салыстырғанда алдыңғы орынға шығады. Сондықтан гендік модификацияланған микроорганизмдер, трансгенді өсімдіктер мен жануарлар өндіретін жаңа дәрілік биопрепараттар өндірілуі медициналық биотехнология саласының перспективті заманауи зерттеулері мен іске асыруы. Рекомбинантты инсулинді, интерферонды, соматотропинді, эритропоэтинді, интерлейкиндерді және басқа пептидті табиғаты бар препараттарды клиникалық практикада кеңінен қолданылады. Гендік инженерия әдістері тұқымқуалайтын аурулар (жайылмалы склероз, Альцгеймер ауруы, паркинсонизм және т.б.) емдеуіне жаңа терапиялық нәруыздар дайындауын қамтамасыз етеді.

Жаңа рекомбинантты нәруыздық препараттардың дүниежүзілік өндірісі қарқынды өсуде: вакциналар, иммунитетті белсендіретіндер, қанды ұйуту факторлары, гранулоцитарлы колония белсендіруші фактор, интерферондар және т.б. Әсер ету спецификасы жоғарлығы, фармакологиялық активтілігі, кері әсері аз болуы, бөгде биологиялық активті заттардан тазалығы, өзіндік құны айтарлықтай төмендігі микроорганизмдер, өсімдіктер және жануарлар клеткаларында адамның нәруыздарының биотехнологиялық өндірісін перспективті түрде дамытуына ықпал жасайды.

Рекомбинантты адамның нәруыздары – бұл адамның нәруызын кодтайтын геннің ДНҚ in vitro-дамикроорганизмдер, өсімдіктер мен жануарлар клеткалар геномына қондырылу жолымен алынған нәруыздар. Осы мақсатта ДНҚ трансформацияланған фрагментін алғашында эндонуклеазалық рестриктазамен өнделінеді. Нәтижесінде «шеттері жабысқақ» ДНҚ пайда болады, олар комплементарлы жабысқақ шеттері бар қандай да болмасын ДНҚ молекуласымен қосыла алады. ДНК-лигаза екі жіпті ковалентті байланыспен бір ДНҚ рекомбинантты молекуласына біріктіреді. Кейін конструкцияланған НҚ молекуласын векторға (вирустар немесе плазмидалар негізінде) қондырып рекомбинантты нәруыздар өндіретін клеткаға (микроорганизмдер, өсімдіктер, сүтқоректілер клеткалары) трансфекцияланады. Рекомбинантты нәруыздың экспрессиясы үшін векторға промотор, рибосома мен терминаторды байланыстыратын сайт, және рекомбинантты нәруызды өндіретін клеткалар селекциясы мен идентификациясын қамтамасыз ететін меркерлі генді енгізеді. Прокариот клеткаларына клондау барысында адам гендерінде интрондар болмауын талап етеді, себебі бактериялар оларды ажырата алмағандықтан қажетті уақыттан тыс терминациясы жүреді, нәруыздың синтезі мен жиналуында бұзылыстар байқалады.

Адам гендерін бактериофаг негізінде дайындалған векторлық жүйеге енгізгенде және соңғысын E.coli клеткасына трансфекцияланған жағдайда, дақылдық ортада, активті ерітінді күйінде клеткадан тыс рекомбинантты нәруыздар жиналуын қамтамасыз етеді. Осындай жағдайда вирустың репродукциясынан бактериялық клетка ыдырайды да рекомбинантты нәруыз клеткадан тыс ортаға түсіп қалады.

Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, экспрессияланатын рекомбинантты нәруыз микроорганизмдер клеткаларының ішінде қалып қоюы мүмкін. Бұл жағдайда толық өнімді алу үшін клетканы бұзу керек және нақты нәруыздың денатурациясы мен ренатурация әдістерін қолданып нәруызды активті ерітінді формаға ауыстыру қажет. Осындай шаралар қажетті өнімнің көп бөлігін жойяды, ал ренатурация процесінде конформациясы дұрыс емес рекомбинантты нәруыздар молекуласы пайда болуы мүмкін, препаратты тазартқанда оларды аластату өте қиын.

Клеткадан немесе клеткадан тыс ортадан рекомбинантты нәруызды бөліп алуындағы де- және ренатурация технологиясынан басқа полистиролді негізді бөлшектерге ковалентті байланыспен иммобилизацияланған никель иондары немесе кобальттың хелатты комплекстері негізінде аффинді хроматография технологиясы қолданылады. Жоғары селективті кобальт немесе никель иондары рекомбинантты нәруыздардың гистидиндік топтарымен координациялық байланыстар орнатады (сур.29). Басқа нәруыздар секілді рекомбинаттылар да алты және одан да көп гистидин қалдықтары бар, олар металдарды байланыстыратын сайт ретінде жұмыс атқарады; осы сайттарды тазарту мен экспрессияда қолданылады. Hexa-His жүйелі қатарды His-соңы деп атайды, оны нысана-нәруыздың N-соңына ендіруге болады. His-соңы құрамына арнайы протеазаларды ыдырататын сайты кіреді. His-соңы бар рекомбинантты нәруыздарды никельді немесе кобальтты ионды колонкалы метало-хелат аффинді хроматография әдісімен, гистидин немесе имидазол көмегімен металл-хелатты колонкадан элюирлеу әдісімен тазартылады. Кейін His-соңы бар тазартылған нәруыздан His-соңын кесіп алу үшін арнайы протеазамен өндейді немесе нәруыздың активті сайтына His-соңы әсер етпейтін болса оларды өндемейді.

Егер рекомбинантты нәруыздар өндірушілері ретінде модификацияланған микроорганизмдер штамдары болса, соңғыларын биореакторларда дақылдандырады; трансгенді өсімдіктер қолданғанда рекомбинантты нәруыз жапырақтарда, жемісте, ұрығында, тамырында жинақталынады; трансгенді жануарларда «биореактор» ретінде сүт безі болады, сүтпен қоса рекомбинантты нәруыздар бөлінеді.

Айтарлықтай әдістемелік қиындықтары мен рентабельдігі төмен болғандықтан өсімдіктер немесе сүтқоректілер клеткалар дақылын in vitro-да өсіру технологиясы сирек қолданылады. Мысалы, осындай процеске қолданатын жануарлар клеткалар дақылдарының барлық түрлерінің жеке дара сипаттамалары болуға тиісті және нәруыздар өндірісінің әр сатысына әртүрлі процесс жағдайын талап етеді. Сондықтан технологиялық процесті өндеу, рекомбинантты нәруыздар өндіруші клеткаларын қалыптастыру және қоректік орталарды жетілдіру – сапалы ақырғы өнімді (нәруызды) максималды бөліп алуы аса маңызды жайт. Сонымен қатар, клетка дақылдары суспензиясында рекомбинантты нәруызды бөліп алуы – бұл биотехнологиялық өндіріс дамуының перспективті бағыты.

Сурет 29. Нәруыздың гистидиндік топтары мен металдар иондарының координациялық

байланыс түзудің сызбанұсқасы

Рекомбинантты терапиялық нәруыздардың биологиялық әсер етуіне байланысты келесі топтарға бөледі:

- гормондар (инсулин, соматотропин және т.б.);

- цитокиндер (интерферондар,интерлейкиндер, сүйек кемігі клеткаларының өсуі факторлары – колония белсендіруші факторлары мен эритропоэтин, өспелер некрозы факторы және т.б.);

- қанды ұйыту факторлары (rt PA тіндік плазминогеннің рекомбинантты активаторы; қанұйыуның рекомбинантты VIII факторы; ұйудың рекомбинантты активтенген VII факторы немесе проконвертин – rVIIa және т.б.);

- ферменттер (рекомбинантты проурокиназа, рекомбинантты альфа-ДНҚ-аза және т.б.);

- вакциналар (гепатит В вирусына қарсы вакцина, ротавирустық инфекцияға қарсы вакцина және т.б.);

- басқа рекомбинантты нәруыздық препараттар.

Химерлі және гуманизирленген моноклонды антиденелер алу технологиясы рекомбинантты нәруыздарға ұқсас келеді.