Сімдіктерде экспрессияланатын рекомбинантты нәруыздар
Табак және кұнбағыс өсімдігіне экспрессияланған бірінші фармацевтік маңызы бар нәруыз 1986 жылы адамның өсу гормоны болды. Зерттеу басында көптеген нәруыздар трансгенді табакқа экспрессияланған және оның жапырағынан экстрагирленген. Келесі жылдары рекомбинантты нәруыздар өндіруші ретінде картоп, сәбіз, күріш және басқа өсімдіктер алынған. Осындай трансгенді өсімдіктер синтездейтін кейбір нәруыздарын медициналық практикада кеңінен қолданылады (кесте 8).
Алғашында осындай ақуыздар адам гендерімен экспрессияланған, кейін ақырғы өнімі төменгі концентрацияда, клеткалардың ерітінді ақуыздарынан 0,1% төмен деңгейде өсімдік ядросының ДНҚ трансфекцияланған. Келешекте зерттеу барысында алған мәліметтер, егер хлоропласттарға адам гені трансформацияланған жағдайда рекомбинантты нәруыздар шығысы 10-100 есе жоғары болды, экспрессия деңгейі 7-11% құрайды. Бір өсімдік клеткада орташа 5-тен 10 мың хлоропластты ДНҚ көшірмесі болады, сондықтан қажетті рекомбинантты ақуыздың экспрессиясының суммарлық деңгейі мақсатқа жеткілікті. Сулы тіндеріне (жапырақ, жемістері) қарағанда биодеградация деңгейі төмен өсімдік ұрықтарының қор тіндеріне мақсатты нәруыздар экспрессиялануы тағы да өнім шығысын 2-3 деңгейге жоғарлату қабілеті бар.
Жоғарғы өсімдіктер клеткаларында сүтқоректілер клеткаларына ұқсас ақуыздардың полипептидті тізбектерінің гликозилирленуі, трансляциядан кейінгі модификация және дұрыс жинақталуы (фолдинг) жүреді. Өсімдіктердің дақылдандыруы қымбат қаражатты жабдықтарды қажет етпейді, ал ауылшаруашылық масштабта егін өнімі шығысы кеңінен терапиялық қолданысқа жеткілікті рекомбинантты препараттың алуына кепілдеме береді. Жануарлармен салыстырғанда өсімдік клеткаларында адамға патогенді вирустар және приондар болмайды, сондықтан медициналық мақсатты рекомбинантты ақуыздардың кауіпсіз көздері болуы мүмкін.
Гендік материалды өсімдік клеткасына тасымалдайтын векторлар:
- өсімдіктер вирустары (темекі мозаикасы вирусы кеңінен қолданылады - ТМВ және сиыр бұршағы мозаика вирусы - СБМВ Nicotiana benthamiana-да);
- бөгде гендерді өсімдік геномына тікелей тасымалдау әдістері (мысалы, микроинъекция, электропорация және ДНҚ биобаллистикасы);
- агробактерияларды Тi-плазмида көмегімен ауыстыру. Ti-плазмиданы қолдануы топырақ бактериясы Agrobacterium tumefaciens өзінің ДНҚ бір бөлігін Т-аймақты плазмида (Ti-плазмида) түрінде өсімдік клеткаға тасымалдауының табиғи қабілеттілігі шектелінеді, тек қос жарнақты өсімдік дақылдарына негізделген.
Трансгенді өсімдіктерде плазмида құрамында тасымалданған гендер клеткада тікелей трансфекцияланған кейін ядро геномына тұрақтанады және келесі ұрпақта сақталып қалады. Вирустық вектордың құрамындағы тасымалданатын гендер өсімдік клеткаларға трансфекциялану барысында рекомбинантты нәруыздың уақытша (транзиторлы) экспрессиясы байқалады. Зақымданған иесі-өсімдіктің вегетация кезеңімен қажетті ақуыздық өнімнің жинақталуын анықтауға болады. Өсімдіктерде вирустық жолмен ақуыздарды жинау жетістіктері – вирустық бөлшектердің көбейю кезеңі қысқа болуы, өсімдіктердің қарапайым жұқтыруы және осы мақсатта әртүрлі өсімдіктер түрлерін қолданудың кең диапазоны.
Сонымен қатар, өсімдіктерді рекомбинантты ақуыздар өндіруші ретінде қолдануы айтарлықтай мәселелерге ие: промотор болғанымен өсімдік клеткасына трансфекциялайтын гендер экспрессиясы деңгейі төмендігі, яғни рекомбинантты ақуыздар шығысы аз болады; өсімдік клетка цитоплазмасында трансфекциялайтын геннің мРНҚ деградация және экспрессиялайтын рекомбинантты ақуыздар протеолизі жылдамдығы жоғары.
«Жеп қойылатын» вакциналарға қоса трансгенді өсімдіктер рекомбинантты терапиялық нәруыздар өндіруші ретінде де сұранысқа ие (кесте 8):
- адамның ИЛ10 және ИЛ18 генімен қоса трансгенді сәбіз өсімдігін құрастыру. ИЛ10 және ИЛ18 рекомбинантты ақуыздар синтездейтін трансгенді сәбіз өсімдігін алу үшін осы нәруыздар синтезін кодтайтын гендерді тасымалдайтын A. tumefaciens рекомбинантты штамм дақылын және алдымен өндіріп алған тұқымдар ұрығынан индуцирленген каллусты дақылмен бірге дақылдандыру көмегімен алады. Адамның интерлейкин 10 және интерлейкин 18 кодтайтын гендерді қажетті праймерлер көмегімен қанның мононуклеарлы клеткалары кДНҚ-нан бөліп алынған мРНҚ қолдана отырып RT-PCR көмегімен клондайды. Осы үшін ДНҚ фрагменттерін рестрикция эндонуклеазасымен өндейді және плазмидаға ендіреді. Секвенациялау жолымен ИЛ кДНҚ нуклеотидті бір ізді қатары бар плазмиданы идентификациялайды. Плазмидаға өндіруші клеткада рекомбинантты ақуыздың экспрессиясын қамтамасыз ету үшін тағы промотор мен полилинкер ендіріледі. Өсімдік-трансформанттың келесі селективті тандалуы және регенерациясы кинетин мен канамицині бар Мурасиге-Скуга қоректік ортада жүргізіледі. Жапырағы жақсы өскен өсімдіктерді 15000 люкс жарық түсетін теплицаға ауыстырады, күндізгі және түнгі жарық түсіру тәртібі 16:8 сағат қатынаста болуға тиісті және температура режимі күндіз 240 С, ал түнде 18-200С ауысуы қадағалынады. Трансгенді сәбіз өсімдік геномында белгілі ИЛ10 және ИЛ18 гендерінің фрагменттері болуы ИФА-анализ көмегімен анықталынады;
- трансгенді темекі өсімдігініңгликоцереброзидаза ферментін алу. Организмде липосомалы гликоцереброзидаза ферменті жеткіліксіздігі Гоше синдромын тудырады. Осы аурудың терапиясының жалғыз емдеу түрі гликоцеребозидазаны вена ішіне енгізу. Ұзақ уақыт осы нәруызды адам плацентасынан алған, бір плацента тіршілігін сақтауына жылына 160000 доллар қаражат керек. Гликоцереброзидаза өнімін сүтқоректілер клеткалар дақылына ауыстыруы осы препараттың құның төмендетті, бірақ ең қымбат дәрілер тобынан шығарылған жоқ. Келе-келе жоғары өнімді трансгенді темекі өсімдігі клетка құрамында адамның гликоцереброзидаза мөлшері ерітінді нәруыздың 1-10% аралықта кездеседі. Осындай өсімдіктерден рекомбинантты гликоцереброзидаза алуы оның құнын едәуір төмендетті.
Кесте 8.Трансгенді өсімдіктер синтездейтін кейбір рекомбинантты ақуыздар
Ақуыз | Қолдану аймағы | Өсімдіктер |
Соматотропин | Өсу гормоны | Темекі өсімдігі, күнбағыс |
Адамның сарысулық альбумині | Бауыр циррозы, күйіктер, хирургия | Темекі өсімдігі, картоп |
Эпидермальды өсу факторы | Тері және көздің мүйізді қабаты клеткалар өсуін белсендіру | Темекі өсімдігі |
Α-Трихосантин | ЖИТС терапиясы | Nicotiana bethamiana |
Интерферондар | Вирустық инфекциялар | күріш, турнепс, картоп |
Интерлейкиндер: IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-18 | Лейшманиоз, адъюванттар | Темекі өсімдігі, картоп, сәбіз |
Эритропоэтин | Анемия | Темекі өсімдігі |
Глюкоцереброзидаза | Гоше ауруы | Темекі өсімдігі |
Гранулоцит-макрофаг-колония белсендіруші фактор | Өспеге қарсы терапия | Темекі өсімдігі |
Дата добавления: 2015-07-14; просмотров: 2258;