Гаплоидная технология. 1В настоящее время наблюдается тенденция обеднения генофонда важнейших растительных культур

1В настоящее время наблюдается тенденция обеднения генофонда важнейших растительных культур. Посевные площади начинают занимать генетически гомогенные суперсорта, что приводит к сужению генофонда для селекции. В этой ситуации возрастет значение метода отдаленной гибридизации, решающего проблему пополнения генофонда культурных видов. Однако, возможности отдаленной гибридизации ограничиваются из-за прогамной и постгамной генетической несовместимости, для преодоления которых успешно применяется метод культуры изолированных зародышей и оплодотворения in vitro.

Эмбриокультура спасает от гибели нежизнеспособные зародыши межвидовых и межродовых гибридов, постепенно становится незаменимым методом преодоления постгамной несовместимости. Этим методом получены многие межвидовые и межродовые гибриды. Успешное культивирование недоразвитых изолированных зародышей зависит от многих факторов и, прежде всего, от стадии развития, степени дифференцировки зародышей в момент изоляции. Трудность выращивания изолированных недифференцированных зародышей обусловлена невозможностью воспроизведения in vitro гормональной функции эндосперма. Существование тесной функциональной связи между зародышем и эндоспермом, особенно в раннем эмбриогенезе было обнаружено именно при культивировании зародышей.

Сравнительное изучение зародышей различных видов в естественных условиях и в культуре, выявило важный этап в ходе эмбриогенеза - автономность развития зародыша, начиная с которой он становится независимым от материнского организма и способен пройти дальнейший эмбриогенез и дать нормальный росток. Определение фазы автономности для каждого вида растений очень важно, потому что с этого времени зародыш может развиваться самостоятельно на питательной среде. Успешное культивирование недоразвитых изолированных зародышей зависит от создания такой питательной среды, которая позволяет закончить формирование и перейти к прорастанию. Универсальной питательной среды для культивирования зародышей нет, поэтому подбор и оптимизация питательной среды является важной процедурой в эмбриокультуре.

Еще одним способом получения растений из зародышей, находящихся на самых ранних стадиях развития, является выращивание in vitro оплодотворенных семяпочек и завязей. При этом почти исключается опасность механического повреждения развивающихся в них зародышей при изоляции и появляется возможность культивировать объекты начиная со стадии зиготы. Эмбриогенез в семяпочках in vitro протекает нормально, если в момент отделения семяпочки присутствует минимальное число ядер эндосперма. При изолировании семяпочки из завязи эмбриогенез протекает нормально даже из семяпочки с зиготой, потому что in vitro образуется эндосперм под влиянием морфогенетического фактора, поступающего из плаценты.

Кроме повышения жизнеспособности зародыша при отдаленной гибридизации эмбриокультура может быть применена для ускорения селекционного процесса путем прерывания состояния покоя семян, сокращения цикла размножения растений, преодоления самостерильности семян.

Благодаря развитию методов культивирования репродуктивных органов стало возможным преодоление также и прогамной несовместимости путем совместной культуры пыльцы и неоплодотворенных семяпочек. За день до раскрытия цветков бутоны срезают, стерилизуют, вычленяют из них пестик или завязь, или семяпочку с плацентой и помещают на питательную среду, предварительно сделав надрез в стенке завязи и обнажив семяпочку. Затем на агар около семяпочки высевают простерилизованную пыльцу, которая прорастая попадает через микропиле семяпочки в зародышевый мешок. Развитие зародыша при оплодотворении в пробирке может протекать нормально. Иногда упрощают эту процедуру, нанося пыльцу на семяпочку и культивируя опыленную семяпочку. Опыление in vitro хорошо удается для растений семейства маковых, гвоздичных, пасленовых, у которых в завязях имеются многочисленные семяпочки.

Дальнейшая разработка методов культивирования генеративных органов цветка в сочетании с эмбриокультурой позволит вести селекцию более эффективно, ибо возрастают возможности для осуществления отдаленной гибридизации.

Для получения гаплоидных растений, представляющих ценный исходный материал для селекции удобно использовать культуру репродуктивных органов пыльников, неоплодотворенных завязей и семяпочек. Основным преимуществом гаплоидной технологии является быстрое получение гомозиготных линий. Такие линии происходят либо из отцовского, либо из материнского геномов репродуктивных клеток, имеют максимальную гомозиготность в отличии от соматических клеток для которых характерна гетерозиготность. Значение гаплоидной технологии было сразу оценено селекционерами из-за значительного сокращения времени для создания гомозиготных линий и получения быстрой информации о ценности тех или иных комбинаций в ранних поколениях.

Гаплоидные растения при культивировании пыльников получены более чем у 70 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, риса, кукурузы. Поскольку гаплоиды, полученные в культуре пыльников несут генотип мужской гаметы, этот процесс называется андрогенезом in vitro. Андрогенез может быть прямым и косвенным. Прямой андрогенез – образование гаплоидных растений-регенерантов благодаря пыльцевому эмбриогенезу, то есть из эмбриоидов, формирующихся путем деления микроспор. Возникновение гаплоидных растений из каллусов, которые образуются в результате дифференциации микроспор, называется косвенным андрогенезом. Не все растения, регенерировавшие из каллусов, являются гаплоидными, поэтому для массового получения гаплоидов необходимо индуцировать пыльцевой эмбриогенез.

В клетках культивируемых пыльников могут идти следующие процессы:

1. эмбриоидогенез;

2. дифференциация и каллусогенез;

3. возникают структуры шаровидной формы, из которых не регенерируют растения;

4. продолжение микроспорогенеза и гаметогенеза;

5. деградация микроспор.

Растения-регенеранты, в том числе гаплоидные, появляются благодаря двум первым процессам.

При нормальном развитии пыльцы in vitro одноядерные микроспоры претерпевают асимметричное деление с образованием генеративной и вегетативной клеток. Вегетативная клетка в дальнейшем остается в состоянии покоя, тогда как генеративная клетка делится, образуя два спермия. В пыльцевых зернах на поздних стадиях запрограммирован гаметофитный путь с образованием спермиев.

Только молодые микроспоры или пыльца, произошедшие непосредственно после первого митоза могут быть индуцированы для перехода на спорофитный путь развития in vitro. При выделении пыльников из цветочных бутонов и помещения их на питательную среду индуцируется спорофитный путь развития микроспор. Внутри пыльника происходят многочисленные деления микроспор и образуется многоклеточный комплекс, из которого формируются различные андрогенные структуру (глобулы, эмбриоиды), дающие начало гаплоидным растениям.

Как же происходит развитие микроспор in vitro? Выяснено 4 основных пути андрогенеза:

1 путь. Микроспора делится на две идентичные дочерние клетки, которые способны к спорофитному развитию. В данном случае не происходит формирования вегетативных и генеративных клеток.

2 путь. Микроспора в результате неравного деления образует вегетативную и генеративную клетки. Спорофиты возникают в результате дальнейшего развития вегетативной клетки, а генеративная клетка дегенерирует (разрушается).

3 путь. Эмбриоиды формируются только из генеративной клетки. В таких случаях вегетативная клетка либо вовсе не делится, либо делится до известного предела.

4 путь. Как и во втором случае, в результате деления одноядерной микроспоры образуются вегетативная и генеративная клетки, которые в дальнейшем делятся и участвуют в развитии спорофита. Затем возможно непосредственное формирование эмбриоидов или образовании спорофитов путем регенерации из каллуса.

Наряду с развитием культуры пыльников и микроспор (андрогенез) в последнее время уделяется большое внимание и культивированию неоплодотворенных завязей и семяпочек, а также зародышевых мешков (гиногенез). Это направление имеет ряд преимуществ перед андрогенезом:

1. получение гаплоидов у мужских стерильных растений возможно только через гиногенез;

2. женский гаметофит является источником гаплоидов у тех растений, у которых андрогенный каллус обладает низкой морфогенетической потенцией или приводит к образованию альбиносов;

3. Зародышевый мешок в отличие от микроспор способен к индукции спорофита на всех стадиях развития.

Новый организм в норме может возникнуть только из зиготы - оплодотворенной яйцеклетки. Однако, в определенных условиях в клетках зародышевого мешка может быть нарушен генетически запрограммированный цикл развития, и начало новому организму, кроме яйцеклетки могут дать и другие элементы зародышевого мешка (синергиды, антиподы). При этом образуются апомиктические зародыши, которые наследуют признаки только материнского организма. Это явление имеет важное значение, так как образующийся зародыш наследует признаки только материнского организма, что и вызвало развитие метода гиногенеза. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек открывает большие возможности для получения гиногенетических гаплоидов (дигаплоидов). Наибольший простор это направление открывает для исследования фундаментальных механизмов реализации морфогенетических потенций клеток и для прикладных разработок по созданию новых исходных форм растений.

Вошло в селекционную практику также получение гаплоидов методом селективной элиминации хромосом в гибридном зародыше. При скрещивании культурного ячменя (Hordeum vulgare) с диким луковичным ячменем Hordeum bulbosum возникают гаплоиды с набором хромосом Hordeum vulgare. На стадии начала роста зародыша и эндосперма происходит элиминация хромосом дикого вида. Гаплоиды возникают из опыляемых растений в обоих случаях скрещивания, когда Hordeum bulbosum служат как материнской, так и отцовской формой. В первом случае появляются гаплоиды дикого вида, во втором – гаплоиды культурного ячменя, что весьма существенно для селекции. Так как гаплоиды стерильны, для получения фертильных растений гаплоиды обязательно должны быть переведены на диплоидный уровень. Дигаплоид, полученный из гаплоидного организма является абсолютно гомозиготным. Использование гибридизации с ячменем луковичным и удвоение хромосом резко сокращает время, необходимое для получения гомозигот. Гаплоиды очень ценны также для мутационной селекции, потому что на гаплоидном уровне облегчается идентификации генетических изменений.

2 Гаплоиды – организмы, в соматических клетках которых содержится одинарный набор хромосом (n), представляющий половину полного набора (2n), свойственного виду. Экспериментальное получение гаплоидов традиционными методами селекции (внутривидовое или межвидовое опыление, облучение рентгеновскими лучами и воздействие другими стрессовыми факторами) малоэффективно и требует много времени. Использование таких приемов, как культивирование in vitro мужского и женского гаметофита, намного ускоряет получение гаплоидов и облегчает селекционный процесс. Экспериментальную гаплоидию можно рассматривать как форму апомиксиса. Апомиксис- размножение организмов, не сопровождающееся половым процессом.

Индуцирование гаплоидов в культуре мужского гаметофита (пыльники, пыльца) называется андрогенезом, в культуре женского гаметофита (семяпочки) гиногенезом. Кроме того, гаплоиды можно вырастить культивируя гибридный зародыш, в котором происходит элиминация хромосом одного из родителей. Иногда гаплоидное растение образуется в процессе псевдогамии – ложного оплодотворения, в результате чего зародыш развивается из неоплодотворенной яйцеклетки.

Впервые гаплоидные растения при культивировании пыльников дурмана были получены С. Гуха и С. Махешвари в Индии в 1964 году. Затем эти опыты повторил на табаке французский ученый К. Нич в 1957 г. С тех пор этим способом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля, рапса и других сельскохозяйственных культур.

Возникновение in vitro гаплоидного сапрофита из мужского гаметофита - процесс сложный и слабоизученный. Микроспоры проходят очень сложный путь, формируя либо каллус, либо эмбриоиды и далее растения-регенеранты. Как индуцируется и регулируется процесс, пока неизвестно.

Нормальное развитие микроспор in vivo складывается из следующих стадий: 1) мейоз, в результате которого из материнской клетки пыльцы образуются тетрады микроспор; 2) освобождение микроспор из утолщенной стенки тетрады; 3) развитие микроспоры с последующим образованием зрелого пыльцевого зерна, сопровождаемое двумя митозами. В культуре отклонение от нормального развития может идти на любой стадии развития микроспоры.