Клеточные технологии в биосинтетической промышленности

1 Этапы работы по созданию клеточных технологий для получения вторичных веществ

1. Экономически обоснованный выбор объекта. Растения, выбранные для введения в культуру, должны содержать значительное количество ценных, экономически важных вторичных соединений. Особенно это относится к редким и исчезающим видам растений.

2. Первичное введение тканей в культуру. Для этих целей отбираются отдельные растения, обладающие наибольшим содержанием искомого вещества. Обычно вначале получают каллусы на твердой среде.

3. Химическое изучение биомассыпо количественному и качественному составу вторичных метаболитов. Пролиферирующие каллусные клетки растений за редким исключением содержат вторичных соединений меньше, чем органы целого растения. Это говорит о том, что в интактном растении синтез вторичных веществ находится под контролем цитодифференцировки. Подавление дифференциации клеток в культуре ведет к снижению их биосинтетического потенциала в отношении вторичных соединений. Неполная реализация генетических возможностей клетки может быть связана и с другими причинами, например с нарушениями автотрофности питания при переходе к гетеротрофному типу питания. Кроме того, под воздействием различных факторов может изменяться качественный состав продуктов. У некоторых растений переход к биосинтезу веществ вторичного метаболизма наступает при замедлении роста, для них применяют двухступенчатые режимы культивирования: вначале создают условия для интенсивного роста клеточной массы, а затем – для биосинтеза веществ. Для эффективного химического контроля за биомассой нужны экспресс-методы оценки веществ.

Следует подчеркнуть, что определение очень низких концентраций метаболитов в медленно растущих клетках представляет большую трудность. Поэтому в качестве экспресс-методов оценки каллусных культур в последнее время применяют радиоиммунохимический и иммуноферментный метод. Последний имеет преимущества благодаря более высокой скорости проведения анализов и возможности их автоматизации.

4.Оптимизация сред и параметров выращивания. Для реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену, требуются специфические условия. Поскольку нет твердой уверенности в том, что используемые питательные среды полностью отвечают потребностям клеток, в каждом конкретном случае приходится подбирать среду и другие факторы, опираясь на опыт других исследователей. Эта работа еще более усложняется при переводе культуры в жидкую среду, так как при этом следует учитывать влияние факторов аэрации и перемешивания.

5. Создание продуктивных штаммов клеток. Получение гомогенной популяции клеток с высоким содержанием тех или иных вторичных веществ- сложная задача, так как популяции длительно культивируемых клеток, даже полученные клонированием одной высокопродуктивной клетки, могут терять способность к синтезу ценного соединения. Для поддержания на высоком уровне способности клеток к видоспецифическим биосинтезам, помимо оптимизации условий выращивания, требуются значительные усилия, включая генетические манипуляции с ними и клеточную селекцию. Для организации рентабельного крупномасштабного производства на основе клеточной технологии нужны мутанты, прототрофные по гормонам, нетребовательные к питательным средам, а также устойчивые к осмотическому и механическому стрессу. Получение мутантов и вариантов в культуре клеток приобретает все большее распространение. Так, обработка каллусных клеток раувольфии змеиной этиленамином позволила получить клеточную линию, отличающуюся высоким содержанием антиаритмического алкалоида аймалина. Дальнейшая оптимизация условий выращивания этой линии привела к увеличению продуктивности культуры по аймалину в 10 раз по сравнению с целым растением. Более эффективным приемом создания продуктивных штаммов является искусственное конструирование клеток методами клеточной и генной инженерии, которым принадлежит будущее.

6. Первичное использование лучших штаммов в суспензионной культуре.Каллусные клетки, первоначально полученные на твердой среде, переводят в жидкую среду.

Изменение режима культивирования не должно приводить к потере штаммом своих положительных качеств, т.е. штамм должен быть устойчив к стрессовым условиям культивирования. Особенно это касается момента переноса клеток из условий лабораторного эксперимента в небольших колбах в ферментеры крупных размеров.

Сейчас в биотехнологических производствах центральная роль принадлежит ферментерам с автоматической регуляцией различных факторов (температуры, газового состава, освещенности, кислотности, содержания физиологически активных веществ) на любом этапе развития культуры.

7.Выращивание продуктивного и устойчивого штамма в условиях, приближающихся к производственным, в ферментерах с последовательным увеличением их емкости. Если в этих полупромышленных условиях культивируемые клетки сохраняют высокие скорости роста и биосинтеза искомого вещества, накапливают его без деградации и в значительных количествах выделяют в среду, то такой штамм пригоден для организации крупнопромышленного производства. Кроме того, важным качеством штамма является его генетическая стабильность.

8. Составление технического регламента на производство биомассы и ее оценка. Производственная технология требует соответствующей аппаратуры, который располагает, в частности, Япония. Так, в 20000-литровом ферментере в непрерывной культуре в течение трех месяцев выращивались клетки табака, продуцировавшие убихинон с продуктивностью по биомассе 5,582 г/л в день. Там также налажено крупномасштабное производство и других вторичных метаболитов.

В н.в. в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них – женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, белладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.

2. Стерилизация - один из важных и необходимых приемов в мик­робиологической технике. Слово «стерилизация» в переводе с латин­ского (sterilis) означает обеспложивание. В микробиологии под стерили­зацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиоло­гической практике стерилизуют питательные среды, посуду, инстру­менты и другие необходимые материалы, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры.

Стерилизация питательных сред и посуды - обязательный момент в работе при выполнении всех задач практикума.

Существуют различные методы стерилизации: физический, меха­нический и химический. Целесообразность применения каждого из них определяется особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими свойствами, химическим составом, целью исследования.

Приготовленная в реакторе - смесителе питательная среда должна быть подвергнута стерилизации. Для стерилизации питательных сред используют два метода: при периодическом культивировании - циклический и при непрерывном культивировании - непрерывный.

Циклический метод стерилизации питательной среды очень прост. Это операцию можно осуществлять непосредственно в ферментере. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно. Чаще всего используют комбинированный нагрев острым и глухим паром. Острый пар подают в питательную среду, а глухой - в рубашку (или змеевик). Острый пар поступает в ферментер через штуцеры для подачи посевного материала, воздуха и для взятия проб. Поэтому вся арматура, соединенная с ферментером, стерилизуется проходящим острым паром.

Так как обработка питательной среды острым паром приводит к образованию конденсата, необходимо заранее учитывать разбавление среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в рецептуру приготавливаемой среды. Тогда к концу стерилизации среда будет иметь необходимую концентрацию всех питательных компонентов.

При циклической стерилизации поддерживают температуру 121^оС, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПА. Обычно питательные среды выдерживают при такой температуре от 30 - 40 мин. Полный цикл нагревания, выдержки и охлаждения для ферментеров большого объёма достигает нескольких часов.

Длительная тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые нестойкие к нагреванию соединения разлагаются, что приводит к потере необходимых для микроорганизмов питательных веществ. Другие соединения могут вступать во взаимодействие между собой с образованием продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. Большинство изменений химических компонентов в составе питательной среды может происходить при температурах, более высоких, чем температура стерилизации. Следовательно, эффективная стерилизация при минимальном изменении состава среды может быть достигнута применением более высокой температуры, быстрым нагреванием и охлаждением среды. Поэтому в настоящее время циклический метод применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объёма.

Метод высокотемпературной непрерывной стерилизации, используемый на большинстве заводов, дает возможность свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации.

При непрерывной стерилизации можно значительно сократить время стерилизации, а, следовательно, снизить расход пара. Кроме того, этот вид стерилизации легко поддается автоматизации.

Для непрерывной стерилизации приготовленная в отдельной емкости питательная среда насосом прокачивается через установку в простерилизованный ферментер.

Применение более высоких температур позволяет резко сократить продолжительность выдерживания среды при максимальной температуре, а периоды нагревания и охлаждения осуществить за несколько секунд.

Если питательная среда не содержит суспендированных частиц, то температура 150 - 160^оС обеспечивает мгновенную стерилизацию. При наличии твердых суспендированных частиц в среде оптимальная для стерилизации температура должна быть ниже, так как требует более длительное время для прогревания таких частиц. В данном случае температура стерилизации составляет 135^оС, а длительность выдержки - от 5 до 15 минут.