I. Приготовление препаратов фиксированных (неживых) клеток и тканей

Гистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной 5-15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенные специальными гистологическими красителями.

Основные этапы приготовления гистологического препарат: 1) взятие и фиксация материала; 2) уплотнение; 3) получение срезов; 4) окрашивание; 5) заключение в консервирующую среду.

Гистологические препараты в зависимости от целей исследования могут быть временными (изготавливаются для однократного изучения) и постоянными (используются длительное время). В качестве среды, в которую заключают временный препарат, используют глицерин или воду.

Фиксация. Цель фиксации заключается в стабилизации живой системы, в остановке в ней процессов жизнедеятельности. При этом необходимо по возможности стремиться сохранить прижизненную структуру изучаемой системы, не вызвав в ней образования структур, не свойственных изучаемому объекту в норме – артефактов.

Фиксаторы могут быть простые и сложные. К простым относят формалин (обычно 10-12% раствор), метиловый спирт, тетраоксид осмия (1-2% раствор) и др. Сложный фиксаторы состоят из нескольких компонентов. Например, в состав смеси Буэна входят формалин, уксусная кислота, пикриновая кислота; в состав жидкости Ценкера – уксусная кислота, сулема, бихромат калия, сульфат натрия.

Продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, размеров и плотности объекта и обычно колеблется от 2 до 24 ч. Для быстрой фиксации материала используют небольшие образцы (0,5-2 см) органов, тканей. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 20-30 раз. В большинстве случаев после фиксации объект промывают водой для удаления фиксатора.

В результате воздействия фиксатора исследуемый образец, как правило, несколько уменьшается и уплотняется. Однако этого уплотнения недостаточно для изготовления из образца материала тонких срезов.

Уплотнение. Целью этого этапа изготовления гистологического препарата является придание исследуемому материалу такой плотности, которая позволит получить срезы необходимой толщины. Этого достигают двумя способами: замораживание образца с последующей резкой на замораживающем микротоме или пропитыванием уплотняющими средами (парафин, целлоидин и др.).

Для заключения в парафин или целлоидин фиксированные образцы подвергают обезвоживанию, так как большинство фиксаторов является водными растворами, и вода не смешивается с уплотняющими средами. Дегидратации (промежуточный этап уплотнения) достигают проведением материала через ряд возрастающих концентраций спирта – 60%, 70%, 80%, 90% растворов и абсолютного – 100% спирта.

Заливка в парафин. Парафин при комнатной температуре находится в твердом состоянии, поэтому перед пропитыванием его подогревают в термостате до 52-56⁰С. Так как парафин не смешивается со спиртами, используют промежуточные среды (ксилол, толуол и др.), которые смешиваются со спиртами, и растворяют парафин, обеспечивая постепенное пропитывание образца заливочной средой.

После дегидратации образца в спиртах его переносят в смесь равных частей ксилола и абсолютного спирта, а затем в чистый ксилол. Далее материал погружают на несколько часов в смесь парафина и ксилола (при температуре 37⁰С), потом на 1-2 ч в чистый расплавленный парафин (при температуре 52-56⁰С), а затем переносят в формы (бумажные или металлические). Из затвердевшего парафина с заключенным в него образцом вырезают прямоугольный блок, который закрепляют расплавленным парафином на деревянном кубике. В таком виде материал готов для резки и получения тонких (4-6 мкм) серийных срезов в виде лент. Следует учитывать, что при парафинировании происходит большее сжатие кусочка, чем при заливке в целлоидин.

Заливка в целлоидин. Целлоидин – специальным образом приготовленная целлюлоза. После дегидратации образец из абсолютного спирта переносят в смесь из равных частей абсолютного спирта и безводного эфира, а затем в 2%, 4% и 8% растворы целлоидина на несколько суток в каждый. Далее материал переносят в густой целлоидин, который уплотняют в парах хлороформа. Из затвердевшего целлоидина вырезают блоки, наклеивают на деревянные кубики и для хранения помещают в 70% спирт. Отрицательными результатами этой заливки являются длительность уплотнения (10-15 суток), невозможность получения срезов тоньше 7-8 мкм, сложность получения серийных срезов.

Изготовление срезов. Для получения срезов используют специальный прибор – микротом. В нем выделяют три основные части: объектодержатель (для закрепления деревянного кубика с блоком); микрометрическую механическую систему (для подачи объектодержателя на заданную величину); держатель микротомного ножа.

Существуют различные конструкции микротомов. Микротомы, снабженные специальными охладительными столиками (замораживающие микротомы), используют в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия фиксатора, например при гистохимических исследованиях. На микротомах этого типа получают срезы толщиной 10-20 мкм и более. Метод замораживания широко используют в патолого-анатомической практике и в клинике как один из экспресс-методов диагностики. Замороженные срезы переносят в воду или сразу на предметное стекло, где они оттаивают и расправляются.

Окрашивание срезов. Красители, применяемы в гистологической практике, по химическим свойствам разделяются на три группы: основные, кислые и нейтральные.

Основные красители (азур II, гематоксилин, кармин и др.) представляют собой соли красящих оснований. Гистологические структуры, избирательно окрашивающиеся основными красителями, называют базофильными. Основные красители окрашивают ядра клеток. Кислые красители (эозин, кислый фуксин и др.) обычно окрашивают цитоплазму и многие неклеточные структуры. Гистологические структуры, окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными. Нейтральные красители представляют собой соли красящего основания и красящей кислоты.

Существуют красители, обладающие способностью либо связываться с химическими компонентами, либо растворяться в них (например, в липидных каплях растворяется Судан III).

Способность гистологических структур определенным образом окрашиваться теми или иными красителями называется тинкториальными свойствами. Структуры, не реагирующие с красителями, называются хромофобными. Окрашивающиеся структуры являются хромофильными (базофильными, оксифильными). В ряде случаев для характеристики тинкториальных свойств используется название красителя, с которым реагируют или не реагируют гистологические структуры. Например, пиронинофильные – окрашенные пиронином, суданофобные – не окрашенные Суданом и т.п. Иногда структуры, имеющие специфический химический состав, меняют при окрашивании цвет красителя. Такое тинкториальное свойство называется метахромазией.