Цитогенетический метод

Цитогенетический метод основан на микроскопическом изучении хромосом. Хромосомы, как индивидуальные структуры становятся доступными в период деления клетки в результате значительного укорочения и утолщения. Наиболее удобной для изучения является стадия метафазы митоза, когда хромосомы наиболее спирализованы и находятся на экваторе клетки. Цитогенетический метод – основа кариотипирования, изучения идиограмм, исследования полового хроматина.

Кариотип – диплоидный набор хромосом клетки, характеризующийся количеством, величиной и формой. Систематизированное изображение кариотипа, где хромосомы пронумерованы в соответствии с их величиной, формой и расположению центромеры называют идиограммой. В 1960г. в г. Денвере, университете штата Колорадо (США) была разработана первая Международная классификация хромосом человека (Денверская классификация), согласно которой все хромосомы человека подразделили на 7 групп в зависимости от формы, размеров хромосом и расположения центромеры. Важным параметром этой классификации является центромерный индекс (ЦИ) хромосом, т.е. отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы (в %).

1. Группа А: 1, 2, 3 крупные метацентрические и субметацентрические хромосомы, ЦИ от 38 до 49

2. Группа В: 4, 5 крупные субметацентрические хромосомы, ЦИ 24-30

3. Группа С: 6 - 12 средние субметацентрические хромосомы, ЦИ 27-35

4. Группа Д: 13 - 15 средние акроцентрические хромосомы, ЦИ около 15

5. Группа Е: 16 - 18 мелкие субметацентрические хромосомы, ЦИ 26-40

6. Группа F: 19, 20 самые мелкие метацентрические хромосомы, ЦИ 36-46

7. Группа G: 21, 22 мелкие акроцентрические хромосомы, ЦИ 13-33

} Х – хромосома относится к группе С

} У – хромосома относится к группе G

Методы изучения хромосом:

1. Прямой метод – исследование клеток костного мозга (используется редко);

2. Непрямые методы: исследование клеток крови, фибробластов кожи, клетки абортированного плода, некропсия органов.

Наиболее удобным обьектом для медицинских генетиков являются лимфоциты периферической крови. Берут 1-2 мл крови и добавляют ее в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений), стимулирующий деление клеток. Продолжительность культивирования составляет 48-72 часа. Затем добавляют колхицин, разрушающий нити веретена деления и прекращение митоза на стадии метафазы. Гипотонический шок вызывают гипотоническим раствором хлорида кальция или цитрата натрия, благодаря чему клетка набухает и лопается. Хромосомы фиксируют, окрашивают и микроскопируют.

Типы окраски: 1) метод Гимзе – рутинная окраска, при которой возможна только групповая идентификация хромосом и определение числовых аномалий кариотипа; 2) дифференциальное окрашивание:а) методы, выявляющие поперечную исчерченность (чередование светлых и темных поперечных полос), специфичную для каждой хромосомы – Q, G и R-окрашивание; б) методы, селективно окрашивающие определенные участки хромосом – C, T и др.

В 1968г. Т. Касперсон предложил метод окрашивания хромосом квинакрином с последующим облучением их ультрафиолетом и индукцией флюоресценции. Оказалось, что в разных районах хромосом выявляется разное число сайтов связывания красителя, которые к тому же сильно варьировали по размерам и интенсивности свечения. Наборы флюоресцирующих полос создавали индивидуальность не только целых хромосом, но и их плеч. В результате каждую хромосому оказалось возможным идентифицировать (Q окраска).

В 1971г. К. Шо, Э. Самнер и У. Шнедл предложили G-окраску. Препараты после предварительной щелочной обработки инкубируют в солевом растворе, а затем окрашивают красителем Романовского-Гимза. В результате появляются темные поперечные полосы. Полосам присваивают определенные номера и относительно них картируют гены. При дифференциальном окрашивании метафазных хромосом в кариотипе человека можно выявить от 200 до 400 специфических полос (бэндов). Если же вместо метафазных хромосом использовать прометафазные хромосомы, то общее число полос в кариотипе может быть увеличено до 800-1200.

Структурные хромосомные аномалии выявляются только при дифференциальном окрашивании. Существуют также дифференцированная энзиматическая окраска, многоцветная флюоресцентная окраска (FISH – fluorescent in situ hybridization), позволяющие определить внутрихромосомные перестройки.

Показания к кариотипированию:

1. Множественные врожденные пороки развития

2. Привычные выкидыши

3. Недифференцированные олигофрении

4. Подозрение на семейную транслокацию

5. Пренатальная диагностика у беременной женщины после 35 лет (или мужа после 45 лет)

6. Уточнение диагноза при нарушении в системе половых хромосом

7. Нарушение репродуктивной функции неясного генеза