Молекулярно-цитогенетические методы

Благодаря достижениям молекулярной генетики последних лет и внедрению в их практику - ДНК-технологии, гибридизация нуклеиновых кислот in situ, компьютерные системы хромосомного анализа - были разработаны принципиально новые методы диагностики хромосомных болезней с помощью генно-инженерных методов, основанных на технологии получения рекомбинантных молекул ДНК и использования их в виде ДНК-проб для диагностики наследственных дефектов. Молекулярно-цитогенетические методы включают проведение всех этапов цитогенетического анализа и, кроме того, приготовление меченых ДНК-проб и проведение молекулярной гибридизации in situ (на препарате). Идентификация хромосомной патологии базируется на основе использования особого типа клонированных фрагментов ДНК человека – хромосомо-специфичных проб ДНК. Используя эти пробы или зонды ДНК (тип клонированных фрагментов ДНК, которые характерны только для определенных пар хромосом), можно определить особенности хромосомного набора без прямого цитогенетического анализа с применением блот-гибридизации или гибридизации in situ.

Особенное распространение в диагностике хромосомной патологии приобрели методы ДНК-гибридизации in situ, FISH-технологии (Fluorescent In Situ Hybridisation) с использованием хромосомо-специфичных ДНК-проб на все хромосомы и их участки, что открывает перспективы для их внедрения в практику диагностики, в том числе и пренатальной (в дородовой диагностике), а также саузерн-блот-анализ, метод прямого (радиоактивного и нерадиоактивного) секвенирования. С помощью этого метода можно проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами (клонированные последовательности или выделенные участки ДНК), меченными флюоресцентными соединениями (биотин, дигоксигенин, Су3-флюорофор и др.).

Принцип метода флюоресцентной гибридизации in situ заключается в следующем: 1. Готовят однонитевый участок ДНК хромосомы или ее участка, который подлежит исследованию. К этому участку присоединяют метки - биотин и дигоксигенин (меченый участок ДНК называется ДНК-зондом) 2. На препарате, используемом для микроскопического исследования in situ, проводится щелочная обработка ДНК; под влиянием щелочи ДНК «расплетается» на две нити. 3. К нитям добавляется ДНК-зонд. Поскольку нити ДНК взаимокомплеметарны (т.е. к одной нуклеотидной паре присоединяется строго определенная другая пара), зонд присоединяется к соответствующему участку хромосомы. При этом восстанавливается двойная спираль (ренатурация ДНК). 4. Полученный препарат обрабатывают химическими соединениями, которые имеют химическое родство с биотином (таким веществом для биотина является стрептовидин) или с дигоксигенином (антидиоксигениновое антитело). 5. К полученным комплексам присоединяют далее флюоресцентные красители (красного цвета - родамин или зеленого цвета - изотиоцианат). 6. Цветная окраска позволяет проводить анализ хромосом с помощью люминисцентного микроскопа довольно отчетливо на фоне неокрашенных хромосом. Количество цветов может быть увеличено за счет других расцветок, если возникает подобная необходимость (трехцветовая флюоресцентная гибридизация и т.д.).

Методы FISH-диагностики широко использую для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, например, у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, в ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки (три зеленые метки). Методы молекулярной цитогенетики позволили повысить верификацию хромосомных болезней. При использовании обычных цитогенетических анализов - доля не выявленных случаев составила 10%, при использовании FISH-технологии - снизилась до 0,9-1,5%. Исследования хромосомных синдромов базируются на основе использования различных типов ДНК-зондов, позволяющих маркировать (метить) индивидуальные хромосомы или их участки. Для успешного практического использования этих методов созданы специальные библиотеки хромосомо-специфичных участков ДНК. ДНК-зонды в последние годы метят различными цветами (цветные FISH-технологии), что позволяет не только повысить качество анализа и проанализировать количественные и структурные перестройки хромосом, но и осуществлять экспресс-диагностику, что особенно важно для пренатальной диагностики.