МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации. Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции.

Ео, Ек — энергия активации реакции без и в присутствии катализатора; DG — разность свободной энергии реакции Рисунок 2.8 - Основное и переходное состояния реагирующих веществ

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями: за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры) или снижения энергии активации соответствующей химической реакции (рисунок 2.8).

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса. Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1) соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S ® E-S;

2) образование активированного переходного состояния: Е-S ® (ES)*;

3) высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* ® Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы»). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов — абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;

2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;

3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ.

Кинетика ферментативных реакций.Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рисунок 2.9, а). График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы (рисунок 2.9, б).

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса — Ментен:

,

где V — стационарная скорость биохимической реакции; V_max — максимальная скорость; К_m — константа Михаэлиса; [S] — концен­трация субстрата.

а

б

Рисунок 2.9 - Зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << К_m, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Тогда .

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f[S] (рисунок 2.9, б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> К_m, когда К_m можно пренебречь, уравнение Михаэлиса — Ментен приобретает вид

, т.е. V=V_max.

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

k₁ k₃

S + Е ES Р + Е

k₂

где S — субстрат; Е — фермент; ES — фермент-субстратный комп­лекс; Р — продукт; k₁ — константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k₂ — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k₃ — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса [ES]. При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции. V_mах — это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса.

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной (см. рисунок 2.9, б). Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

.

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. К_m имеет малые значения, когда k₁ >(k₂ + k₃), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения К_m, тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если К_m имеет большое значение, то (k₂ + k₃) > k₁ и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов. Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы — это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы — это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на спе­цифические и неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов — это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие, но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием, или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз — отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц, входящих в их со­став.

Многие ферменты могут находиться в двух формах: в виде про­стого белка и в виде фосфопротеида. Переход из одной формы в дру­гую сопровождается изменением каталитической активности.

Скорость ферментативной реакции зависит от количества фермента, которое в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ регуляции скорости ферментативной реакции является более медленным процессом, чем регуляция активности фер­мента.