Схема. 1. Схема оптимизации ПС.
Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели:
> концентрация потребляемого субстрата;
> время потребления;
> концентрация биомассы;
> коэффициент метаболизма;
> константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;
> концентрация субстрата в начальный момент культивирования.
Обычно при периодическом процессе культивирования большинство важных параметров, в том числе и концентрация питательных веществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вместе с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возникает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост микробной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение концентрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добавлением в ферментер, по определенной программе, позволяет исключить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов.
Стандартизация питательных сред
Кроме оптимизированного состава, питательные среды, используемые в микробиологической практике для выполнения различных экспериментальных работ, а также для выпуска стабильных по своим свойствам биопрепаратов, должны быть стандартны.
Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному, жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию витаминов, углеводородов, антибиотиков и др. компонентов.
Многогранность и сложность проблемы стандартизации обуславливают необходимость использования комплексного подхода к решению данных задач, который предусматривает не только разработку требований к качеству сырья, материалов, полуфабрикатов, унификацию технологии оснастки оборудования, но также и разработку совокупности мероприятий, методов и средств, направленных на установление, обеспечение и поддержание необходимого уровня качества препарата на всех стадиях его изготовления и применения.
Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС промышленного изготовления и сухих витаминсодержащих добавок.
Примером может служить технология изготовления сухого ферментативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, который широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт кормовых дрожжей.
Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их удорожанию, но это считается оправданным, т.к. применение разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего эксперимента, к появлению брака и к получению несопоставимых результатов.
Создание и развитие системы оценки стандартности состава и свойств ПС, оценка воспроизводимости технологии их приготовления являются как одними из основных принципов конструирования ПС, так и передовыми задачами развития микробиологии на современном этапе.
1.4. ПОДГОТОВКА БИОРЕАКТОРА К ПОСЕВУ
Современные биореакторы изготавливаются из нержавеющей стали и представляют собой довольно сложный аппарат, в который осуществляют закачку соответствующей для культивируемого микроба питательной cреды.
Реактор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной фурнитурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью 150-200 об/мин и трубка для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подающей и отводящей трубок, смотровое окно, окно для освещения и отверстие для вставления четырёх сифонов, служащих для внесения посевного материала, взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необходимости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различными измерительными приборами.
Регулирование температуры осуществляется автоматически. Регистрация её, а также измерения рН осуществляется с помощью электронного потенциометра.
При первичной установке реакторов в цехах и при их последующей эксплуатации важной инженерно-технической проблемой является технологическая обвязка биореакторов трубопроводами. К комплексу наиболее важных проблем технологической обвязки относятся:
1. Стерилизация внутренней полости реактора текучим паром.
2. Подача стерильного воздуха во внутреннюю полость реактора при культивировании, либо при удалении готового продукта из неё на последующую обработку.
Решение этих проблем позволяет получать более стабильные результаты по стерильности и накоплению микробной массы при реакторном способе культивирования микроорганизмов.
1.5. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕАКТОРЕ И КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением:
1. Активной аэрации микробных культур.
2. В покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации).
3. В состоянии анаэробиоза.
Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации
Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в УНСи охлажденную до 25-35°С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма питательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8.
Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий.
Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата.
Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.
Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.
Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).
В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры.
Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации
Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются.
Применяют баллонный и реакторный способы культивирования.
Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в 16-литровых стеклянных баллонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной (производственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток.
При реакторном способе культивирование проводят в ферментерах, которые могут быть объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л.
Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов
К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.
В силу биологических особенностей анаэробов методы культивирования их в промышленности имеют свои особенности.
1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём заполнения анаэро(бо)статов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а остаточный кислород может быть удалён путём каталитического связывания с воздухом.
Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой кислоты.
2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстановительным потенциалом (Eh). Для этих целей в среду вводят окислительно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин)-10-4 ч л -1, меняющий цвет от сине-розового до бесцветного. Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий.
3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно корректировать рН среды, поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.
1.6. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ И ХЕМОСТАТНЫЕ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических, или "закрытых", и хемостатных (непрерывных) - "открытых" системах.
Закрытой называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.
Открытая (хемостатная) система - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомасса самих микроорганизмов. При этом скорость поступления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной нам среде размножения микроорганизмов.
Дата добавления: 2016-05-11; просмотров: 1050;