А – обобщенная схема хроматографа; б – хорошо разрешенная хроматограмма четырехкомпонентной смеси

На рис. 4.2, б в качестве примера представлена хроматограмма, со­держащая информацию о разделяемой биопробе. Число пиков соответ­ствует исходному количеству компонентов; а по оси абсцисс отложе­ны величины времени «удерживания» каждого конкретного компонен­та внутри колонки, т. е. времени его эффективного выделения из об­щей смеси (t₁ — время удерживания для вещества, сорбирующегося наименее прочно).

Эффективность разделения пропорциональна длине колонки, но при увеличении ее длины происходит размывание зоны каждого ком­понента и, следовательно, расширение пиков (ширина пика пропор­циональна времени нахождения вещества в колонке), поэтому длину колонки необходимо ограничивать.

Описанный процесс отражает только самые общие черты хроматографического процесса, каждый вариант ХрГ имеет свои аппара­турные особенности, использует иные материалы для НФ и ПФ и требует различный режимов разделения. Поэтому для более деталь­ного ознакомления рассмотрим основные хроматографические мето­ды по отдельности.

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Адсорбционная хроматография основана на различной степени ад­сорбции компонентов исследуемой пробы на пористом адсорбенте. В зависимости от агрегатного состояния ПФ различают твердожидкост­ную адсорбционную ТЖАд или газоадсорбционную(Гад) ХрГ.

Пористые материалы обладают способностью достаточно прочно сорбировать различные вещества. В твердожидкостном варианте на границе твердой и жидкой фаз частицы твердого адсорбента обтекают­ся ПФ, несущей в растворенном виде анализируемую биопробу. Ее разделение происходит за счет того, что компоненты с различной прочностью удерживаются на поверхности адсорбента. При выполне­нии газоадсорбционного варианта растворитель заменяется на газ-но­ситель, который переносит по колонке газообразную смесь компонен­тов биопробы.

В качестве НФ в адсорбционной хроматографии используются не­сколько видов материалов.

Силикагелъ. Этот материал получают из золей кремневой кислоты, при этом в зависимости от условий проведения реакции образуются нерегулярные или сферические частицы различной величины и порис­тости. Хроматографию при нормальном давлении обычно проводят на сорбентах с размерами частиц 40...60 мкм, при высоком давлении — на сорбентах с размерами 3, 5, 7, 10 мкм. Важной характеристикой сорбента наряду с размерами частиц является средний диаметр их пор.

Силикагели применяются:

— для фракционирования неполярных и малополярных веществ;

— контроля качества разделения (главным образом, при высоком давлении на колонках с размером частиц 3... 15 мкм);

— препаративного фракционирования при нормальном дав-лении на сорбентах с размерами частиц 10...30 мкм;

— препаративного разделения в производственном масштабе на сорбентах с диаметрами частиц 60...200 и 200...500 мкм.

Оксид алюминия. Этот адсорбент характеризуется не только раз­мерами частиц, но и кислотно-оcновными свойствами: водная сус­пензия адсорбента может иметь кислую, нейтральную или основную реакцию. Кроме того, адсорбент может обладать различной степенью активности.

Оксид алюминия применяют для решения тех же задач, что и силикагель: на кислом оксиде алюминия разделяют вещества с кислот­ными свойствами (фенолы, карбоновые кислоты). На основном окси­де алюминия фракционируют основания (амины), а также удаляют перекиси, присутствующие в органических растворителях (эфире, диоксане и др.).

Поверхностно-модифицированный силикагель. К находящимся на поверхности частиц диоксида кремния атомам могут быть прикреп­лены различные группы (например, посредством ковалентной связи), полностью покрывающие поверхность силикагеля, вследствие чего по­лярный сорбент приобретает гидрофобные свойства. Наиболее прочная адсорбция неполярных и умеренно полярных соединений наблюдается в водной среде. Десорбция происходит в присутствии органических растворителей. Поверхностно-модифицированные силикагели приме­няют, в основном, в хроматографии с обращенными фазами для аналитического и полупрепаративного разделения, главным образом, полярных веществ.

КОЛОНОЧНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Метод колоночной жидкостной хроматографии (КлЖХрГ) впер­вые был предложен в 1906 г. как метод разделения смеси веществ, по­зволяющий осуществлять эту операцию как на микроуровне, так и при решении препаративных задач.

Неподвижную фазу помещают в колонку, затем вносят в нее ана­лизируемую смесь (биопробу) и элюируют соответствующим раство­рителем (ПФ). При продвижении по колонке компоненты смеси по-разному удерживаются сорбентом в зависимости от своих физи­ко-химических свойств и, следовательно, перемещаются с разной ско­ростью. На выходе колонки разделяемые вещества появляются в опре­деленной последовательности и могут быть собраны в виде отдельных фракций.

В (КлЖХрГ) конечный результат зависит не только от того, на­сколько принцип разделения (адсорбция, распределение, ионообмен или гель-хроматография) соответствует свойствам анализируемых ве­ществ, но и от множества других факторов:

— свойств системы сорбент-элюент;

— условий элюирования (скорость потока, температура, вяз-кость элюента);

— конструкции и размеров колонки;

— нагрузки колонки (количество пробы);

— качества упаковки колонки;

— размеров частиц, среднего диаметра пор частиц сорбента;

— конструкции основных элементов хроматографической сис-темы (блок ввода пробы, мертвый объем в соединительных шлангах и ячей­ке детектора);

—качества подготовки пробы.

Качество разделения (эффективность работы колонки) зависит так­же от равномерности ее упаковки и от скорости установления равнове­сия между актами адсорбции — десорбции вещества.

Основное преимущество (КлЖХрГ) перед газовой состоит в возмож­ности разделения веществ при более низких температурах (в диапазо­не от температуры замерзания до кипения растворителя), поэтому этот метод позволяет разделять термически неустойчивые вещества (напри­мер, белки), которые нельзя испарить без разрушения.

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НИЗКОГО ДАВЛЕНИЯ

В жидкостной хроматографии низкого давления компоненты смеси разделяют в хроматографической колонке при нормальном (гидроста­тическом) или несколько повышенном давлении. С помощью этого ва­рианта можно разделять разнообразные вещества — от низкомолеку­лярных соединений до сложных биополимеров и их комплексов.

Факторами, обеспечивающими оптимальное разрешение, являются: небольшие размеры частиц сорбента и их возможно более узкий фрак­ционный состав, небольшая скорость подачи элюента и малая вязкость элюента (вследствие чего быстро устанавливается диффузионное рав­новесие), возможно более высокая температура.

Обычно разделение на мягких сорбентах (сефадексы, биогели, гели агарозы и полистирольные гели) проводят при атмосферном дав­лении. Этот вид хроматографии применяют для переработки больших объемов жидкости, когда не ставится задача достижения высокого раз­решения и нет ограничений по продолжительности эксперимента. Если скорость подачи ПФ достаточно высока, то частицы сорбента должны иметь сравнительно крупные размеры. В аналитических лабораториях колончатую (ЖХрГ) низкого давления проводят на сорбентах с диамет­ром частиц 40...60 мкм, в производственных условиях — с диаметром 100...200 мкм и более.

Коротко опишем основную аппаратуру, необходимую для прове­дения данного типа (ЖХрГ).

Хроматографическая система (рис. 4.4.) включает: резервуар или градиентный смеситель для размещения ПФ, насос для подачи ПФ, устройство ввода пробы, колонку, детектор для обнаружения компо­нентов пробы в элюате, самописец, автоматизированный коллектор для сбора фракций.

Устройства ввода пробы. Непосредственное внесение биопробы осуществляется при помощи пипетки или тефлонового капилляра, конец которого (длиной ≈ 3 мм) изогнут под углом 90°. Биопробу с высоким удельным весом помещают под слой растворителя на столбик сорбента при помощи специального адаптера—поршня, который ограничивает высоту слоя сорбента в колонке. Большие объемы жидкости подают на колонку из резервуаров через систему специальных кранов. Иногда био­пробу вносят при помощи дозирующей петли, которую при нормальном давлении заполняют раствором биопробы, после чего переносят ее в ко­лонку. Этот способ применяют при внесении небольших объемов. Био­пробу предварительно фильтруют или центрифугируют для того, чтобы отделить коллоидные частицы и механические примеси.

Рис. 4.4. Общая схема хроматографической установки для ЖХрГ низкого давления:

Градиентный смеситель; 2 – смеситель; 3 – резервуар; 4 – насос; 5 – проба; 6 – вентиль переключения потока; 7 – адаптер; 8 – сорбент; 10 – самописец; 11 – коллектор для сбора фракций

Колонки. Конструкция колонки имеет первостепенное значение для эффективности разделения. Для изготовления деталей, контактирую­щих с органическими растворителями, в них используют инертные ма­териалы (стекло, тефлон, нержавеющая сталь).

Скорость элюента (ПФ) устанавливают в зависимости от типа сор­бента и свойств разделяемых веществ. В адсорбционной и ионообмен­ной хроматографии удовлетворительное разделение получают при вы­сокой скорости элюирования, в гель-хроматографии скорость элюирования не должна превышать 10 см/ч (фронт элюента перемещается по колонке на расстояние 10см за 1 ч). Эта так называемая линейная ско­рость подачи элюента не зависит от размеров колонки. При анализе высокомолекулярных веществ скорость подачи элюента должна быть на порядок меньше. В хроматографии при нормальном давлении дей­ствует правило: чем меньше скорость элюирования, тем выше качест­во разделения.

После разделения в колонке выходящие фракции поступают в хроматографический детектор — прибор, позволяющий регистрировать появление компонента смеси в потоке ПФ по его характерным физи­ко-химическим свойствам (окраске, флуоресценции, поглощению излу­чения и др.), где производится их количественный анализ. Более под­робно детекторы рассмотрены в специальной литературе.

При проведении препаративной хроматографии элюат собирают по фракциям на фракционном коллекторе, причем смена фракций в за­висимости от типа коллектора может происходить по истечении задан­ного промежутка времени, при достижении заданного объема фракции или сбора заданного числа капель.

низкого давления, как правило, применяется для препаратив­ного разделения неорганических (ионообменная хроматография), Орга­нических (адсорбционная и распределительная хроматография) веществ и биополимеров (ионообменная, аффинная, гель-хроматография).

Лекция №9

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭ(ЖХрГ) представляет собой метод разделения веществ на мелкозернистых сор­бентах (с размерами частиц 3...15 мкм) при повышенном давлении. Ме­тод характеризуется высокой эффективностью разделения в сочетании с высокой скоростью процесса. Принципиально ВЭ(ЖХрГ) мало отличается от (ЖХрГ) низкого давления, однако из-за высокого рабочего дав­ления (до 4,107 Па) приборы для высокоэффективной (ЖХрГ) сущест­венно отличаются. Вследствие небольших размеров частиц сорбента и их однородности разделяющая способность колонок для этого метода существенно выше. Высокое разрешение, а следовательно, возмож­ность использования коротких колонок позволяют сократить продол­жительность процесса и уменьшить расход растворителей. Обязатель­ными также являются высокое качество устройства ввода пробы и ми­нимальный объем измерительной ячейки детектора.

К подвижным фазам предъявляются особые требования:

— высокое качество очистки (особо чистые растворители);

— отсутствие взвешенных частиц (фильтрование на входе колонки на фильтре с диаметром пор менее 4 мкм)

— минимальная вязкость;

— учет условий работы детектора (растворитель не должен погло­щать при рабочей длине волны);

— отсутствие ионов, способных вызывать коррозию металличе­ских частей хроматографа.

Структурная схема многоцелевого жидкостного хроматографа, ис­пользующего методику градиентного элюирования, представлена на рис. 4.5. Из крана-смесителя жидкая ПФ под высоким давлением по­ступает в хроматограф, который находится в термостате, сначала — через змеевик, где она принимает рабочую температуру, затем — че­рез предколонку с той же насадкой, что и основная колонка. Предколонка выполняет следующие функции:

—достижение равновесия между ПФ и сорбентом;

—роль фильтра, удаляющего оставшиеся примеси.

Биопробу вводят между предколонкой и основной колонкой. Элю­ат из колонки проходит через измерительную ячейку дифференциаль­ного детектора к коллектору фракций или сливу. Поток элюента, про­ходящего через сравнительную ячейку детектора, отделяют от основ­ного потока элюента до ввода биопробы. В более простых и дешевых системах могут отсутствовать следующие блоки: змеевик (нет контро­ля температуры), предколонка, а также может использоваться более простой детектор.

Градиентный смеситель. Наиболее простой моделью градиентного смесителя является система из двух сообщающихся сосудов, также применяемая в (ЖХрГ) низкого давления. Более современные модели градиентных смесителей снабжены клапанами, управляемыми при по­мощи микропроцессоров. Преимущество таких моделей заключается в том, что для создания градиента концентрации достаточно одного на­соса. Иногда используют модель с двумя насосами в едином блоке с микропроцессором. В этом случае градиент формируют в области вы­соких давлений, т. е. на входе в колонку. В большинстве случаев впол­не достаточно однократной дегазации растворителей путем выдержи­вания их в вакууме.

Рис. 4.5. Технологическая схема типичного жидкостного хроматографа с приспособлением для градиентного элюирования

Устройства ввода биопробы. В настоящее время редко пользуются шприцами для ввода биопроб, так как к ним предъявляются высокие требования по герметичности. Чаще всего используют петлевые доза­торы, которые позволяют вводить ее при рабочем давлении.

Колонки представляют собой трубки из нержавеющей стали с хоро­шо отполированной внутренней поверхностью. Применение коротких колонок и сорбентов с диаметром частиц 5 мкм и менее позволяет достигнуть очень высокого разрешения при небольших затратах. Наи­более распространенными являются колонки следующих типов:

—колонки для аналитического разделения размером 4x250 или 4 125 мм

—колонки для препаративного разделения с внутренним диамет­ром 8, 10, 16мм и длиной 250 и 500мм.

Сорбенты. Для всех вариантов высокоэффективной ЖХрГ, за ис­ключением аффинной хроматографии, выпускаются специальные сор­бенты (некоторые из них были рассмотрены ранее). Трудности появля­ются при работе с мелкими фракциями, в частности, сложной пробле­мой является приготовление стабильных суспензий. Высокой воспро­изводимости упаковки достигают также при использовании поверхно­стно-пористых сорбентов (непористое ядро и пористый поверхностный слой) с частицами диаметром 20...30 мкм. Эти сорбенты обладают не­большой емкостью и используются, главным образом, для аналитиче­ских целей.

Областями применения этого вида ХрГ являются ускоренный ана­лиз разнообразных смесей при высоком разрешении, высокой чувстви­тельности и хорошей воспроизводимости, а также препаративное раз­деление веществ в количестве от нескольких миллиграммов до не­скольких граммов.

КОЛОНОЧНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ

Колоночная газовая хроматография КлГХрГ является методом разделения летучих веществ: газов (при нормальной температуре) или паров (при повышенной температуре). В качестве неподвижной фазы в ГХрГ используются твердые материалы (насадочные или набивные ко­лонки), твердые материалы, покрытые слоем жидкости, или же капил­ляры с нанесенным на внутреннюю поверхность слоем жидкости (ка­пиллярные колонки). В качестве ПФ используют газ-носитель, перено­сящий разделяемые вещества через колонку. Разделение анализируе­мой смеси осуществляется за счет различного времени удерживания компонентов пробы в неподвижной фазе.

Основные группы органических веществ, которые могут быть оп­ределены методом ГХрГ, включают газы, летучие жидкие соединения, твердые частицы, жидкие аэрозоли и главным требованием для ве­ществ, разделяемых ГХрГ, является их достаточная устойчивость при температурах, которые необходимы для поддержания биопробы в газо­образном состоянии.

Между жидкостной и газовой хроматографией не существует принципиальной разницы. ГХрГ отличается лишь свойствами подвиж­ной фазы: высокой скоростью диффузии газа-носителя и его способно­стью сжиматься. Достоинствами газовой хроматографии являются:

— возможность идентификации и количественного определения индивидуальных компонентов сложных смесей;

— возможность анализа широкого круга объектов — от легких га­зов до ВМ органических соединений и некоторых металлов;

— высокая четкость разделения и быстрота процесса, обусловлен­ная низкой вязкостью ПФ;

— возможность исследования микропроб и автоматизация записи получаемых результатов, обусловленная наличием чувствительных и малоинерционных детекторов;

— возможность выделения чистых веществ в промышленных мас­штабах;

— пригодность для исследования малых объемов жидких биопроб (0,01…50 мкл).

Максимальная разделяющая способность колонки в ГХ зависит от:

— количества НФ, качества упаковки, толщины слоя;

— размера (диапазона размеров) частиц материала-носителя;

— размеров колонки;

— вязкости газа-носителя (а следовательно, и температуры в ко­лонке).

В зависимости от состояния неподвижной фазы различают газоад­сорбционную ГАдХрГ и газожидкостную (или распределительную) хроматографию ГЖХрГ. В ГАдХрГ в качестве НФ используется ад­сорбент, а в основе разделения лежит механизм адсорбции; в ГЖХрГ неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на инертный мате­риал-носитель, а в основе разделения лежит распределительный меха­низм. Растворимость анализируемых веществ в НФ определяется зави­симостью давления паров растворенного вещества от его концентра­ции в жидкой фазе.

Вид хроматограммы, полученной в изотермических условиях, представлен на рис. 4.7. Время удерживания конкретного компонента в колонке зависит от вероятности попадания молекул вещества в ПФ. При этом компоненты с высоким давлением паров и соответственно низкой растворимостью в НФ удерживаются слабее и, наоборот, веще­ства с низким давлением пара и высокой растворимостью элюируются позже. Если в процессе разделения температуру повышают, то говорят 6 газовой хроматографии при программируемой температуре.

Рис. 4.7. Хроматограмма, полученная в изотермических условиях

Рис. 4.8. Схема газового хроматографа:

Баллон с газом-носителем; 2 — игольчатый вентиль баллона; 3—регулятор потока газа-но­сителя(дроссель); 4— дозирующее устройство (блок ввода пробы); 5— хроматографическая ко­лонка; 6 — термостат; 7 —ротаметр; 8 — детектор (пламенно-ионизационный); 9 и 10 — система для подачи газов в детектор (водород и воздух в случае ПИД); 11 — электронный блок обработ­ки сигнала (интегратор); 12 — самописец

Обобщенная схема установки для ГХрГ приведена на рис. 4.8. В ГХрГ применяют три типа колонок (рис. 4.9.).

1. Насадочные колонки. Такие колонки изготавливаются из стек­лянных или металлических трубок (нержавеющая сталь) U-образной или спиралевидной формы. Они характеризуются большой поверхно­стью и высокой разделяющей способностью, однако обладают боль­шим сопротивлением, что ведет к неравномерности потока газа-носителя. Хотя теоретически разделяющая способность растет с увеличе­нием длины колонки, на практике преимущество длинных колонок сводится на нет из-за увеличения сопротивления. Оптимальной дли­ной насадочной колонки является 0,5... 10 м при внутреннем диаметре 1...5.мм.

Рис. 4.9. Типы колонок для ГХрГ: