ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Под общим названием хроматографияХрГобъединены методы разделения вещества биопробы на отдельные компоненты, в основе которых лежит процесс распределения этих компонентов между не­подвижной (стационарной) и подвижной фазами, перемещающимися друг относительно друга. В зависимости от строения разделяемые компоненты в различной степени удерживаются той и другой фазами и вследствие этого могут быть отделены друг от друга.

Под действием диффузии и других физико-химических механизмов молекулы разделяемых веществ пересекают поверхность раздела обеих фаз. Этот процесс можно охарактеризовать как элементарный акт взаимодействия анализируемого вещества (сорбата) с неподвижной фазой (сорбентом). Данный акт взаимодействия осуществляется мно­гократно, причем каждый раз достигается некоторый эффект разделе­ния. Чем эффективнее такой элементарный акт и чем чаще он повторя­ется, тем выше эффект разделения, или, иными словами, выше разре­шающая способность процесса. При продвижении компонентов иссле­дуемой смеси (биопробы) в разделяющей среде такой процесс межфа­зового перехода можно описать как многократное повторение актов сорбции и десорбции. По Завершении процесса компоненты удержива­ются той или иной фазой в зависимости от своих свойств.

В основу классификации вариантов хроматографии могут быть положены различные критерии:

— агрегатное состояние фаз;

— природа элементарного (единичного) акта взаимодействия;

— аппаратурное оформление процесса;

— способ относительного перемещения фаз;

— конечная цель процесса.

Рассмотрим каждый из перечисленных вариантов более подробно.

1. Агрегатное состояние фаз. Обычно данный критерий является основным, так как природа элементарных актов сорбции-десорбции на твердой и жидкой фазах принципиально различна. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы (ПФ) различают жидкостнуюЖХрГ и газовую ГХрГ хроматографию.

В ЖХрГ роль неподвижной фазы (НФ) обычно играет сорбент, а в качестве ПФ используется элюент (растворитель). В этом случае про­цесс разделения в значительной степени определяется составом ПФ, в качестве которой используется множество веществ, при этом для каж­дого случая необходимо подбирать подходящую систему разделения.

В ГХрГ в качестве носителя биопробы — ПФ выступает газ, а в основе лежат процессы распределения между фазами и адсорбции, по­этому ГХрГ делится на адсорбционную (НФ — твердое вещество) и жидкостную (НФ — жидкость). Свойства газа-носителя имеют второ­степенное значение для процесса разделения, он служит только для перемещения разделяемой смеси.

2. Природа элементарного (единичного) акта взаи-модействия. Известно несколько вариантов единичного акта взаимодействия иссле­дуемой среды с веществами НФ и ПФ фаз.

А. Адсорбция разделяемых веществ на поверхности адсорбента. При использовании твердой НФ жидкие и газообразные биопробы разделяются на основе отличий в адсорбционном сродстве их компонен­тов с веществом НФ — классический вариант хроматографии. Адсорб­ция может быть обусловлена либо физическими ван-дер-ваальсовыми силами межмолекулярного взаимодействия, либо химическими связя­ми (в процессе реакции при обмене ионов разделяемых компонентов на ионы адсорбента). В последнем случае взаимодействуют ионы НФ и раствора. Разделение смеси ионов в растворе основано на степени их сродства к твердой фазе, в качестве которой выступает вещество — ионообменник, способное обмениваться ионами с жидкой биопробой.

Явление адсорбции лежит в основе адсорбционной ХрГ — АдХрГ, причем в первом варианте она реализуется как молекулярная адсорбционная ХрГ — МАдХрГ, а во втором — как ионообменная ад­сорбционная — ИОАдХрГ.

Б. Различия в растворимости веществ. Этот вариант реализуется при использовании жидкой НФ. Элементарный акт взаимодействия, как правило, является актом растворения (абсорбции) компонентов биопробы в растворителе (жидкая фаза) и распределении их между ПФ и НФ (распределительная ХрГ — РХрГ). Разделение биопробы на компоненты основано на различии коэффициентов распределения веществ либо между жидкими НФ и ПФ, либо между жидкой и газо­образной фазами. Если в качестве НФ используется специальный гель с определенными размерами пор, а разделение пробы основано на раз­личной степени проникновения молекул веществ в поры геля, то этот вариант определяется как гель-хроматография— ГеХрГ.

В. Водородная связь или химическое сродство компонентов веще­ства биопробы с материалом НФ. Разделение происходит за счет хи­мического взаимодействия с образованием плохо растворимого осадка (хемосорбционная, или осадочная, ХрГ — ХСХрГ).Широкого приме­нения этот вариант хроматографии не нашел.

Г. Биоспецифическое взаимодействие. В основе сродства лежат су­губо специфичные взаимодействия между компонентами по принципу «ключ-замок». Такой вариант известен под названием аффинная ХрГ — АфХрГ).

В реальных условиях почти всегда одновременно с основным про­цессом взаимодействия компонентов пробы с НФ протекают и другие процессы, которые также вносят свой вклад в механизм разделения. Например, на ионообменниках дополнительно может протекать про­цесс адсорбции на твердой фазе, в распределительной наряду, с растворением вещества в жидкой НФ может наблюдаться адсорбция на поверхности раздела газ-жидкость и т. д. Поэтому при проведении разделения надо стремиться к тому, чтобы действие побочных процес­сов было сведено к минимуму.

3. Аппаратурное оформление процесса. По способу размещения НФ различают колоночную, капиллярную, тонкослойную хроматогра­фию и хроматографию в полях сил. Способ размещения НФ в значи­тельной степени определяет конструкцию хроматографа — прибора в котором протекает процесс разделения пробы. Результатом выполне­ния исследования является хроматограмма — графическая запись, от­ражающая информацию о выделенных компонентах (чаще всего — в виде пиков, амплитуда которых пропорциональна их количественному соотношению).

4. Способ относительного перемещения фаз. В зависимости от характера перемещения сорбирующихся веществ вдоль слоя сорбента различают проявителъный (элюентный), фронтальный и вытеснительный варианты хроматографического процесса. Их схематические изо­бражения и хроматограммы представлены на рис. 4.1. По оси ординат на графиках отложено свойство выходного потока, зависящее от его состава (например, концентрация компонента), по оси абсцисс — вре­мя разделения.

5. Конечная цель процесса. Хроматографию можно рассматривать как гибридный метод, в котором технологический процесс представля­ет собой часть аналитической системы, сочетающей разделение и из­мерение. В связи с этим сам хроматографический процесс может ис­пользоваться либо в технологических задачах, связанных с получением материальных продуктов (препаративное применение ХрГ), либо для получения информации о качественном и количественном составе и физико-химических свойствах исследуемых объектов (аналитическое применение ХрГ). В последнем случае хроматография может приме­няться в сочетании с другими физико-химическими методами.

ОБЩАЯ МЕТОДИЧЕСКАЯ СХЕМА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Для понимания технологии проведения хроматографического раз­деления рассмотрим в самых общих чертах обобщенную схему хрома­тографа, которая представлена на рис. 4.2, а. Здесь представлены толь­ко основные блоки хроматографа (в реальных условиях аппаратура для проведения колоночного варианта разделения включает много до­полнительных элементов).

Непосредственно процесс разделения пробы на отдельные компо­ненты происходит в колонке 2, предварительно заполненной подвиж­ной фазой (сорбентом). Подача ПФ в колонку осуществляется с помо­щью специального устройства ввода 3. Исходную биопробу вносят до­затором 1 (конструкция его определяется агрегатным состоянием про­бы и типом подвижной фазы (ПФ)). Для хорошего разделения биопробу необходимо вво­дить в колонку в виде небольшой компактной дозы, тогда все компо­ненты смеси начинают перемещаться одновременно.

По мере продвижения через колонку компоненты смеси сорбиру­ются в верхних слоях сорбента, причем менее сорбирующиеся компо­ненты перемещаются быстрее, чем прочно сорбирующиеся компонен­ты. При хорошем качестве разделения слои сорбированных веществ вымываются практически полностью, и на выходе колонки получается поток растворителя, содержащего последовательно все компоненты анализируемой смеси. Далее выделенные компоненты поступают в де­тектор 4, где происходит их идентификация или количественное опре­деление. Детектор представляет собой сложное устройство, основным элементом которого является чувствительный элемент (датчик), опре­деленным образом реагирующий на свойства исследуемых компонен­тов. На его выходе установлен самописец 5 — регистрирующее уст­ройство, графически отображающий сигналы детектора в виде хроматограммы. Как правило, колонка и детектор хроматографа находятся внутри термостата 6, который обеспечивает требуемый температурный режим разделения.

Рис. 4.2. Принцип хроматографического разделения биопробы: