Определение числа клеток высевом на питательные среды

В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возможность определить число только жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного посева, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые на ней не растут или растут крайне медленно.

Микрокультуральный количественный анализ основан либо на определении колониеобразующих единиц - классический чашечный метод, либо на учете популяциеобразующих единиц - классический метод предельных разведении. В основе обоих методов лежит предположение о том, что для образования популяции в жидкой среде или колонии на плотной среде необходимо и достаточно наличия в исследуемом образце одной живой микробной клетки.

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов в чашки Петри и подсчета выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония - потомство одной клетки. Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев в плотную среду на чашки Петри, подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений.Разведения исследуемой суспензии готовят на стерильном физиологическом растворе (0.85%-ный раствор хлорида натрия), используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, т.к. это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильным физиологическим раствором разливают по 9 (4.5) мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 (0.5) мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 (4.5) мл физиологического раствора - это первое разведение, 10^-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая и в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз. Затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во вторую пробирку - получается второе разведение, 10^-2. Таким же образом готовят и последующие разведения. Количество разведений зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов: соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции. Обычно перед проведением серийных десятикратных разведений исследуемую суспензию разводят до 10⁸-10⁹ микробных клеток в мл с помощью оптического стандарта мутности ГИСК им.Л.А. Тарасевича, что существенно облегчает проведение эксперимента и подсчет результата.

Следует помнить, что для приготовления каждого разведения необходимо обязательно сменить (использовать новую) пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Проведение посева.Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационных вод. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на край крышки на 20-40 мин в термальную комнату или сушильный шкаф при температуре 35-70°С. Следует помнить, что все операции с лабораторной посудой с готовыми к употреблению средами необходимо проводить с максимальным соблюдением антисептики и асептики. Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки Петри на 2-3 суток крышками вниз (не открывая), при комнатной температуре. После того, как среда приготовлена, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0.05 или 0.1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды.

Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждых делают 3-4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом следует начинать с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0.5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 43-50°С агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду не разливают по пробиркам, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2-4 чашки Петри. Затем заливают чашки 15-20 мл расплавленной и остуженной до 48-50°С плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином.

Подсчет выросших колоний:Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей - через 5-7, колонки актиномицетов - через 7-15 суток инкубации в термостатах.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Удобны для подсчета автоматические счетчики, срабатывающие на контакт ручного зонда с колонией. Недостатком этих счетчиков является необходимость повреждения колоний зондом. Существуют и другие счетчики, лишенные данного недостатка.

Для подсчета числа колоний чашку Петри крышкой вниз помешают на специальный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают число колоний пером с пружинным острием (2). Острием пера касаются дна чашки Петри в участке/ соответствующем положению колонии, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкает цепь, и показание счетчика (3) увеличивается на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, а цепь размыкается.

Лучшим следует считать то разведение,при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30-50 до 100-150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата (М) вычисляют по формуле:

где: а – среднее число колоний при высеве из данного разведения;

10 – коэффициент разведения;

n - порядковый номер разведения, ив которого сделан высев;

V - объем суспензии, взятый для посева (мл).

Определение количества клеток высевом в жидкие среды.В зарубежной литературе этот метод получил название метода наиболее вероятного числа (most probable number) или сокращенно MPN. Метод основан на известном принципе альтернативного ответа "все или ничего". Для его осуществления из исследуемого материала готовят ряд последовательных разведений. Затем определенным объемом (обычно 1 мл) каждого разведения зазевают пробирки с жидкой прозрачной питательной средой, причем каждое разведение высевают в 3-5 параллельных пробирок. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 3 до 10 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, гага или накопление в среде продуктов метаболизма.

Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последующих разведений. Затем по таблице находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.