Подсчет клеток в счетных камерах

Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис.3), хотя можно применять и другие счетные камеры. Камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 0.04 мм² (большой квадрат) или 0.0025 мм² (малый квадрат). Может быть указано 1/25 мм² или 1/400 мм² соответственно.

Часть предметного стекла, на который нанесена сетка, на 0.1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.

При работе с камерой необходимо соблюдать особый порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры, убивают нагреванием или суспендированием в0.5%-ном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8x или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, т.к. его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 малых квадратах сетки, перемещая подсчет по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата, при подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом 10, в противном случае суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток должно быть не менее 600 (3 повтора по 200 клеток при однократном монтаже камеры).

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток лучше повторять 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток (М) в 1 мл (см³) исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

где: а -среднее число клеток вквадрате сетки;

10³ - коэффициент перевода (мм³ в cm³);

h - глубина камеры (мм);

S - площадь квадрата сетки (мм²);

n - разведение исследуемой суспензии.