ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 14 страница

Мешающие факторы

Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента.

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.2.

Раствор A - испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов).

Растворы B - серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции).

Растворы C - серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Таблица 27.2

Схема эксперимента "Мешающие факторы"

Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Результаты и интерпретация. Результаты эксперимента считаются достоверными, если:

- для раствора D получены отрицательные результаты во всех повторностях;

- для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда;

- для раствора A получены отрицательные результаты во всех повторностях.

По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов B, рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5 лямбда и не более 2 лямбда, испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами, и может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если присутствие мешающих факторов обнаружено для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно снять действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения.

Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому КСЭ к раствору испытуемого лекарственного средства добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ Мешающие факторы. Если после обработки выбранным способом результаты анализа Мешающие факторы окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье.

Анализ проводят с лекарственным средством в одном разведении, в котором был проведен анализ Мешающие факторы, или в большем разведении, но не превышающем значения МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.3.

Раствор A - испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР.

Раствор B - испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Раствор C - раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2 лямбда (положительный контроль).

Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.3

Схема эксперимента "Качественный анализ"

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

- для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;

- для раствора C (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты;

- для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты.

Если для раствора A в обеих повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в разведении, равном МДР.

- Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела "Бактериальные эндотоксины" частной фармакопейной статьи.

Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора A, то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для обеих повторностей получены отрицательные результаты.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД B)

Задачей этого анализа является определение содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве. Для этого используется серия последовательных разведений испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, для которого был проведен анализ Мешающие факторы, или большего, но не превышающего МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.4.

Растворы A - разведение испытуемого лекарственного средства, начиная с разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор B - испытуемое лекарственное средство в наименьшем из проверяемых в тесте разведений, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Растворы C - серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.4

Схема эксперимента "Количественный анализ"

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

- для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;

- для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда;

- для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в обеих повторностях;

- для растворов A конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (лямбда) равно концентрации эндотоксина в растворе A, полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива.

Если во всех повторностях серии растворов A получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве менее чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наименьший фактор разведения.

Если во всех повторностях серии растворов A получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве более чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наибольший фактор разведения.

Лекарственное средство считают выдержавшим испытания, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье.

28. ИСПЫТАНИЕ НА ГИСТАМИН (ОФС 42-0063-07)

Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.

Подготовка изолированного органа

В опыт берут морскую свинку-самца с массой тела 200-350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют воду. После эвтаназии свинку обескровливают путем декапитации. Вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место ее перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1-2 см до этого места.

Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают ее основание и отрезают ножницами. Отсеченный конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая ее, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая ее. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10-15 см, ближайшие к слепой кишке.

Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Им осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от +2 до +4 град. C (примечание 2).

Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа).

Приготовление разведений стандартного образца и

испытуемого лекарственного средства <*>

--------------------------------

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат".

1. Разведения стандартного образца

В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид в

-6

трех разведениях: разведение 1 (1,25 x 10 г/мл); разведение 2 (2,50 x

-6 -6

10 г/мл) разведение 3 (5,00 x 10 г/мл), вызывающие 50, 75 и 100%

сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0,9%

раствор натрия хлорида.

2. Разведение испытуемого препарата (ИП)

Испытанию подвергают неразведенный ИП, когда максимально допустимая

нормативной документацией концентрация гистамина в неразведенном

-6

лекарственном средстве находится в диапазоне от 1,25 x 10 г/мл до 2,50 x

-6

10 г/мл. При необходимости ИП разводят 0,9% раствор натрия хлорида таким

образом, чтобы предполагаемая концентрация гистамина дигидрохлорида в

-6

разведении ИП составляла 2,50 x 10 г/мл.

Регистрирующая система

Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение стандартного образца и ИП используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде (35 град. C), а также электронного датчика с самописцем или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% O2 и 5% CO2) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500-800 мг. В случае использования механического рычага, для ее вычисления следует применять правило равновесия:

Сила x Плечо силы = Нагрузка x Плечо нагрузки.

Проведение опыта

Изолированный отрезок подвздошный кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один - к крючку на дне ванночки, а другой - к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее трех раз сменить в ванночке раствор Тироде.

1. Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к субмаксимальной дозе гистамина

В термостатируемую ванночку вводят стандартный образец в разведении 3 в объеме, равном 1/100 от ее емкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объемом раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объемом раствора. Не менее чем через 4 мин. после первого введения снова повторяют цикл "введение-экспозиция-два отмывания". Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными.

2. Испытание ИП на гистамин

Предварительное испытание

После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение стандартного образца в разведении 3, проводят испытание ИП на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин. однократно, в случайном порядке вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП. Циклы "введение-экспозиция-два отмывания" такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.

В случае если пик, полученный в ответ на введение ИП, по высоте не меньше, чем пик стандартного образца в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИП (2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИП, меньше пика стандартного образца в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (2.2).

2.1. Количественное испытание ИП на гистамин

В случайном порядке поочередно вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП до получения не менее чем четырех пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на стандартный образец от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют, какой концентрации гистамина в разведении ИП соответствует средняя высота его пика и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном ИП (см. подраздел "Статистическая обработка результатов испытания на гистамин" общей фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний").

ИП считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое нормативной документацией (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).

2.2. Контрольное испытание

Схема его проведения такая же, как и при количественном определении

содержания гистамина в ИП, за исключением того, что вместо ИП используют

стандартный образец в разведении 2. Если средняя высота его пика

соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном

-6

разведении (2,50 x 10 г/мл), то результаты опыта следует признать

достоверными.

Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих

случаев:

1) Средняя высота пика стандартного образца в разведении 2 не

соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном

-6

разведении (2,50 x 10 г/мл).

2) При количественном определении содержания гистамина в ИП отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИП.

3) В процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4).

В каждом из этих трех случаев следует провести испытание ИП на вещества депрессорного действия (см. "Испытание на депрессорные вещества").

Примечания

1. Состав и приготовление гипокальциевого раствора Тироде

Состав:

NaCl 80,00 г

NaHCO3 10,00 г

D-глюкоза 11,00 г

KCl 2,00 г

CaCl2 x 2H20 1,30 г

MgCl2 x 6H20 2,10 г

NaH2PO4 x H20 0,58 г

Воды дистиллированной до 10 л

Приготовление

В мерном цилиндре объемом 1 л растворяют в дистиллированной воде навески NaCl, NaHCO3 и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объем раствора водой до 1 л и переливают содержимое цилиндра в 10-литровый стеклянный или полиэтиленовый сосуд с притертой пробкой или завинчивающейся крышкой.

Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды дистиллированной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:

1) KCl

2) CaCl2 x 2H20

3) MgCl2 x 6H20

4) NaH2PO4 x H2O

Затем доливают воду дистиллированную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.

Полученный раствор может храниться при температуре от +3 до +5 град. C не более 24 ч. Помутнение недопустимо.

Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать дистиллированной водой. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.

2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед тем как отрезки использовать в опыте, их следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин. выдерживают при комнатной температуре и в течение 20 мин. в термостате (35 град. C). После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается легкими поглаживающими движениями в продольном направлении.

3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причем направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.

Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты - 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа, писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.

4. Каждую серию, состоящую не менее чем из четырех пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять на дрейф с помощью теста Нойманна:

n - 1 2

n SUM (x - x )

i = 1 1 i + 1

D = -------------------------,

n 2 2

n SUM x - (SUM x )

i = 1 i

где: x - высота пика на введение одного и того же раствора;

n - число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора.

Значение D должно быть (p < 0,05):

при n = 4 - меньше 0,78;

при n = 5 - меньше 0,82;

при n = 6 - меньше 0,89.

29. ИСПЫТАНИЕ НА ДЕПРЕССОРНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ОФС 42-0064-07)

Настоящая статья распространяется на определение веществ депрессорного действия in vivo в лекарственных средствах для парентерального применения.

Подготовка животного к опыту

В опыт берут здоровых кошек любого пола массой не менее 2 кг. Самки не должны быть беременными или лактирующими. За 24 ч до опыта животное лишают корма, но оставляют свободный доступ к воде. В качестве наркоза используют гексенал в дозе 350-400 мг/кг, который вводят внутримышечно. Можно использовать любой другой наркоз, не оказывающий существенное влияние на величину артериального давления.

Животное фиксируют в станке в положении на спине. Препарируют сонную артерию, в которую вставляют канюлю, заполненную раствором, предупреждающим свертывание крови (в качестве антикоагулянта используют 25% раствор магния сульфата или раствор гепарина, содержащий 50 ЕД в 1 мл и др.). Канюлю соединяют при помощи системы трубок, заполненных тем же раствором, с ртутным манометром или электронным датчиком для регистрации кровяного давления. Запись давления производят на ленте кимографа или другого регистрирующего устройства. Испытуемое лекарственное средство <*> вводят через иглу, вставленную в отпрепарированную бедренную вену.

--------------------------------

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат".

Приготовление разведений стандартного образца

испытуемого препарата (ИП)

В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид. Все разведения следует проводить в пересчете на гистамин-основание (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038). Для разведения стандартного образца используют тот же растворитель, что и для ИП: воду для инъекций или 0,9% изотонический раствор натрия хлорида для инъекций, в зависимости от растворителя, указанного в соответствующем частном нормативном документе. Концентрация рабочих разведений стандартного образца в пересчете на гистамин-основание должна составлять 0,5 мкг/мл (разведение 1) и 1,0 мкг/мл (разведение 2).

Проведение опыта

Введение растворов на протяжении всего опыта проводят со скоростью 0,1 мл в секунду и интервалом между введениями не менее 5 мин.

В начале опыта проверяют чувствительность животного к гистамину. Для этого в вену последовательно вводят стандартный образец в разведении 1 и разведении 2 в объеме 0,2 мл на 1 кг массы. Животных, у которых при введении стандартного образца в разведении 2 в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы величина артериального давления снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают.

После проверки чувствительности животного к гистамину определяют величину гипотензивной реакции введением стандартного образца в разведении 1 в объеме 0,2 мл раствора на 1 кг массы тела. Введение гистамина повторяют, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимают за стандартное в данных условиях опыта.

Затем кошке однократно вводят раствор ИП. Тест-доза и растворитель указаны в частном нормативном документе.

ИП считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение стандартного образца в разведении 1.

При испытании на одном животном двух и более ИП необходимо периодически проводить определение величины снижения артериального давления в ответ на введение стандартного образца в разведении 1. В случае значительного уменьшения величины реакции артериального давления по сравнению со стандартной величиной, полученной в начале опыта, необходимо вновь проверить чувствительность животного к действию стандартного образца в разведении 2, как описано выше. Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм рт. ст., испытание ИП продолжают в соответствии с указанными выше требованиями.

30. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ СЕРДЕЧНЫЕ

ГЛИКОЗИДЫ (ОФС 42-0065-07)

Биологической оценке подлежат:

1. Листья наперстянки пурпуровой, крупноцветковой и их лекарственные препараты.

2. Лекарственные препараты наперстянки шерстистой.

3. Трава, лекарственные препараты горицвета.

4. Трава, листья, цветки ландыша, лекарственные препараты ландыша, сложные лекарственные формы, содержащие настойку ландыша.

5. Семена и лекарственные препараты строфанта.

6. Трава и семя желтушника раскидистого (серого), сложные лекарственные формы, содержащие лекарственные препараты желтушника серого.

Принцип метода биологической оценки

Биологическая оценка указанных выше лекарственных средств основана на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах систолическую остановку сердца животных.

Активность сердечных лекарственных средств оценивают по сравнению с активностью стандартных образцов и выражают в единицах действия (ЕД).

Испытания проводят на лягушках или кошках. Устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемого лекарственного средства <*>, вызывающие систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1 г испытуемого препарата (ИП), если испытываются лекарственное растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке - при испытании таблеток или в 1 мл, если испытываются жидкие лекарственные формы.

--------------------------------

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат".

Стандартные образцы и понятие единицы действия

Стандартным образцом при испытании травы, листьев, цветков ландыша, лекарственных препаратов ландыша, сложных лекарственных форм, содержащих настойку ландыша, служат специально изготовленные спиртовые экстракты ландыша, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ.