ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 17 страница

Приведенные ниже методы определения микробиологической чистоты распространяются на нестерильные лекарственные средства (субстанции и препараты), вспомогательные вещества и полупродукты, а также используются при определении эффективности антимикробных консервантов и мониторинге производственных помещений фармацевтических предприятий и лабораторий контрольных служб.

В табл. 32.1 и 32.2 приведены требования к лекарственным средствам (лекарственным препаратам и субстанциям), а также вспомогательным веществам, используемым в производстве лекарственных препаратов.

Таблица 32.1

Микробиологическая чистота лекарственных препаратов

┌─────────┬──────────────────────────────┬────────────────────────────────┐

│Категория│ Препараты │ Рекомендуемые требования │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│1 │Препараты, к которым │Препараты должны быть │

│ │предъявляется требование │стерильными │

│ │"стерильность" │ │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│2 │- Для применения местно, │- Общее число аэробных бактерий │

│ │наружно, интравагинально │и грибов (суммарно) не более │

│ │- Для введения в полости уха, │ 2 │

│ │носа │10 в 1 г или в 1 мл, или на │

│ │- Респираторно │1 пластырь (включая клейкую │

│ │- Трансдермальные пластыри │сторону и основу) │

│ │ │- Отсутствие энтеробактерий и │

│ │За исключением тех │других грамотрицательных │

│ │лекарственных препаратов, │бактерий на 1 пластырь (включая │

│ │которые должны быть │клейкую сторону и основу) │

│ │стерильными │ 1 │

│ │ │- Не более 10 энтеробактерий и │

│ │ │других грамотрицательных │

│ │ │бактерий в 1 г или в 1 мл │

│ │ │остальных препаратов │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │aeruginosa в 1 г или в 1 мл, или│

│ │ │на 1 пластырь (включая клейкую │

│ │ │сторону и основу) │

│ │ │- Отсутствие Staphylococcus │

│ │ │aureus в 1 г или в 1 мл, или на │

│ │ │1 пластырь (включая клейкую │

│ │ │сторону и основу) │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│3 │А. Для приема внутрь или │- Общее число аэробных бактерий │

│ │введения ректально │ 3 │

│ │ │не более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов не более │

│ │ │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │ │1 г или в 1 мл │

│ │ │ │

│ │Б. Для приема внутрь - из │- Общее число аэробных бактерий │

│ │сырья природного происхождения│ 4 │

│ │(животного, растительного или │не более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │минерального), уровень │- Общее число грибов не более │

│ │микробной загрязненности │ 2 │

│ │которого невозможно снизить в │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │процессе предварительной │- Энтеробактерий и других │

│ │обработки и относительно │грамотрицательных бактерий не │

│ │которого федеральный орган │ 2 │

│ │контроля качества │более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │лекарственных средств │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │допускает уровень микробной │1 г или в 1 мл │

│ │ 3 │- Отсутствие Salmonella в 10 г │

│ │загрязненности более 10 │или в 10 мл │

│ │жизнеспособных микроорганизмов│- Отсутствие Staphylococcus │

│ │в 1 г или в 1 мл │aureus в 1 г или в 1 мл │

│ │ │ │

│ │Исключением являются │ │

│ │лекарственные растительные │ │

│ │средства, включенные в │ │

│ │Категорию 4 │ │

│ │ │ │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│4 │Лекарственные растительные │- Общее число аэробных бактерий │

│ │средства, состоящие из одного │ 7 │

│ │вида сырья (фасованная │не более 10 в 1 г │

│ │продукция) или нескольких │- Общее число грибов не более │

│ │(сборы), а также растительное │ 5 │

│ │сырье "ангро" │10 в 1 г │

│ │ │ 2 │

│ │ │- Escherichia coli не более 10 │

│ │ │в 1 г │

│ │ │ │

│ │А. Лекарственные растительные │- Общее число аэробных бактерий │

│ │средства или лекарственное │ 5 │

│ │сырье "ангро", применяемые в │не более 10 в 1 г │

│ │виде настоев и отваров, │- Общее число грибов не более │

│ │приготовленные с │ 4 │

│ │использованием кипящей воды │10 в 1 г │

│ │ │ │

│ │Б. Лекарственные растительные │- Энтеробактерий и других │

│ │средства или растительное │грамотрицательных бактерий │

│ │сырье "ангро", приготовленные │ 3 │

│ │без использования кипящей воды│не более 10 в 1 г │

│ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │ │1 г │

│ │ │- Отсутствие Salmonella в 10 г │

└─────────┴──────────────────────────────┴────────────────────────────────┘

Таблица 32.2

Микробиологическая чистота субстанций и

вспомогательных веществ для производства

лекарственных препаратов

┌─────────┬──────────────────────────────┬────────────────────────────────┐

│Категория│ Субстанции, вспомогательные │ Рекомендуемые нормы │

│ │ вещества │ │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│1.2 │Субстанции для производства: │Субстанции должны быть │

│ │А. Стерильных лекарственных │стерильными │

│ │препаратов, которые не │ │

│ │подвергаются стерилизации │ │

│ │ │ │

│ │Б. Стерильных лекарственных │- Общее число аэробных бактерий │

│ │препаратов, которые │и грибов (суммарно) не более │

│ │подвергаются стерилизации │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие энтеробактерий │

│ │ │в 1 г или в 1 мл │

│ │В. Нестерильных лекарственных │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │препаратов, относящихся к │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │

│ │Категории 2 │- Отсутствие Staphylococcus │

│ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│2.2 │Субстанции синтетического │- Общее число аэробных бактерий │

│ │происхождения для производства│ 3 │

│ │нестерильных лекарственных │не более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │препаратов │- Общее число грибов не более │

│ │ │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │ │1 г или в 1 мл │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│3.2 │Субстанции природного │- Общее число аэробных бактерий │

│ │происхождения (растительного, │ 4 │

│ │животного или минерального) │не более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │для производства нестерильных │- Общее число грибов не более │

│ │лекарственных препаратов │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │ │1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Salmonella в 10 г │

│ │ │или в 10 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Staphylococcus │

│ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │

│ │ │ 2 │

│ │ │- Энтеробактерий не более 10 │

│ │ │в 1 г или в 1 мл │

├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│4.2 │Вспомогательные вещества (мука│- Общее число аэробных бактерий │

│ │пшеничная, крахмал, тальк и │ 3 │

│ │т.д.) │не более 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов не более │

│ │ │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │

│ │ │1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Salmonella в 10 г │

│ │ │или в 10 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Staphylococcus │

│ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Других энтеробактерий не более│

│ │ │ 2 │

│ │ │10 в 1 г или в 1 мл │

└─────────┴──────────────────────────────┴────────────────────────────────┘

Примечания к табл. 32.1 и 32.2

1. В нормативных документах могут быть указаны в виде исключения и другие нормы в зависимости от состава препарата и особенностей технологического процесса производства.

2. В нормативных документах на препараты для детей должны быть введены более жесткие нормы, а именно: количество аэробных бактерий в 1 г или в 1 мл - в пределах от 100 до 500, количество грибов - от 10 до 50, отсутствие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

3. При обнаружении во время проведения испытания других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ не соответствует требованиям по показателю "микробиологическая чистота".

Испытание на микробиологическую чистоту включает способы подготовки образцов различных лекарственных форм перед испытанием, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных бактерий и грибов, выявление и идентификацию отдельных видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в нестерильных лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы и реактивы.

Испытание проводят в асептических условиях, чтобы предотвратить контаминацию исследуемых образцов.

1. Определение антимикробного действия лекарственного средства

Перед проведением контроля необходимо определить, обладает ли исследуемое лекарственное средство в условиях испытания на микробиологическую чистоту антимикробным действием, подавляющим рост отдельных видов бактерий и грибов, так как это может привести к неправильной оценке результатов анализа.

Для определения антимикробного действия используют тест-микроорганизмы, представленные в табл. 32.3.

Таблица 32.3

Тест-микроорганизмы для определения

антимикробного действия

Кроме вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать и другие микроорганизмы из различных коллекций, типичные по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства.

КонсультантПлюс: примечание.

Нумерация абзацев дана в соответствии с официальным текстом документа.

1.2. Работа с тест-микроорганизмами

Ампулы с лиофилизированными культурами бактерий и грибов вскрывают в асептических условиях и вносят в них около 0,5 мл соответствующей жидкой питательной среды (например, среда N 8 - для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans). Полученную взвесь тест-культур переносят в пробирки с теми же жидкими питательными средами и инкубируют при соответствующей температуре в течение 24 ч (бактерии) или 48 ч (C.albicans). После 2-3-х пассажей с бульона на бульон культуру микроорганизмов пересевают с помощью бактериологической петли на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше, считая полученную культуру исходной.

Культуру A.niger пересевают на агар Сабуро и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут. до появления конидий (экзогенных спор черного или темно-коричневого цвета).

Культуры бактерий пересевают каждый месяц, грибов - каждые 3 месяца, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего используют новую ампулу или исходную культуру со среды хранения.

Тест-штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град. C в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.

Тест-культуру C.albicans хранят под слоем стерильного вазелинового масла на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 0,5%. Тест-культуру A.niger хранят на среде N 2.

При пересеве культур со сред хранения предварительно удаляют слой масла над агаром, бактериологической петлей снимают верхний слой агара с выросшей культурой и переносят его в пробирки со средой N 8 для бактерий, жидкой средой Сабуро - для C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро - при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч для C.albicans. Для получения конидий культуру A.niger пересевают на среду N 2 и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут.

1.2.1. Приготовление спор B.subtilis

Если не удается получить гомогенную взвесь клеток B.subtilis, используют споры, получаемые следующим образом.

Культуру B.subtilis выращивают в пробирке на скошенном соево-казеиновом агаре или среде N 1 в течение 24 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Смывают 5 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида со стерильными стеклянными бусами. Взвесь бактерий переносят в матрац с 300 мл скошенного питательного агара, содержащего для ускорения спорообразования марганца сульфат в количестве 1 мг/л среды. Посевы инкубируют в течение 7 сут. при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Для подтверждения достаточного образования спор выросшую культуру микроскопируют. Если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90% спор, делают смыв культуры, внося в матрац 45 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Нагревают полученную взвесь 30 мин. на водяной бане при температуре 65 град. C, центрифугируют при 4300 об./мин. в течение 15 мин., отмывают не менее 3 раз стерильным 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида до полной прозрачности надосадочной жидкости. Снова нагревают на бане при температуре 65 град. C в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин., ресуспендируют осадок (споры) в том же растворе, определяют количество спор в 1 мл чашечным агаровым методом. Хранят суспензию спор при (5 +/- 1) град. C в запаянных ампулах или пробирках не менее 8 недель.

1.3. Проведение испытания

Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов.

1.3.1. Разведение лекарственного средства

Готовят необходимые разведения лекарственного средства 1:10, 1:50, 1:100, 1:500 и 1:1000 методом последовательных разведений, используя фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0 (п. 4.2.).

1.3.2. Приготовление инокулята

24-часовые бульонные культуры бактерий на соево-казеиновом бульоне или

среде N 8 и 48-часовую культуру C.albicans на бульонной среде Сабуро

разводят стерильным раствором натрия хлорида 0,9% изотоническим 1:1000

(B.cereus, C.albicans) и 1:100000 (E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus)

до концентрации около 10 КОЕ/мл. Взвесь спор B.subtilis также разводят до

концентрации 10 в 1 мл. Культуру A.niger смывают со скошенного агара

Сабуро или со среды N 2 фосфатным буферным раствором с 0,05% твина-80.

Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или

чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 10 КОЕ/мл.

1.3.3. Метод определения антимикробного действия в условиях испытания на микробиологическую чистоту

Каждое разведение препарата в количестве 1 мл вносят в 6 чашек Петри диаметром 90 мм, в две из которых добавляют по 0,2 мл взвеси спор B.subtilis, в две другие - по 0,2 мл взвеси культуры C.albicans, в 2 последние - 0,2 мл взвеси конидий A.niger. Чашки с бактериями заливают 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (47,5 +/- 2,5) град. C питательного агара, чашки с культурами грибов - тем же количеством среды Сабуро. По 1,0 мл каждого разведения препарата вносят в пробирки с 10 мл жидких сред N 3 и N 8 (или аналогичных), куда затем добавляют по 1 мл взвеси Е.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus соответственно средам, каждый микроорганизм отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений препарата вносят такое же количество растворителя. Опыт ставят в двойной повторности. Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч (среды N 3, 8) и 5 сут. (среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут.

После окончания сроков инкубации отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках без препарата и наличие или отсутствие роста тест-штаммов на средах с различными разведениями препарата. В случае помутнения или изменения окраски среды, затрудняющих учет результатов, делают пересевы на агаризованные среды. При росте типичных колоний E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus отмечают отсутствие антимикробного действия исследуемого препарата.

1.3.4. Метод репликаций

Для водонерастворимых (суспензии, эмульсии и др.) или окрашенных соединений предпочтительно использовать метод репликаций.

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого препарата. В контрольные чашки вносят по 1 мл разбавителя, используемого для получения разведений. В чашки Петри как в эксперименте, так и в контроле, добавляют по 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (45 +/- 2) град. C соево-казеинового агара или среды N 1, в другие - такое же количество среды Сабуро и тщательно перемешивают. Опыт ставят в двойной повторности.

После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды, на которую затем бактериологической петлей, пипеткой или репликатором наносят инокулят (п. 1.3.2.) каждого тест-штамма бактерий и грибов в виде бляшек на среды N 1 и N 2 (или аналогичные) соответственно. Чашки с соево-казиновым агаром или средой N 1 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч. Чашки со средой Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение не более 5 сут.

1.4. Учет и интерпретация результатов

Наличие такого же роста тест-микроорганизмов, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый, замедленный или угнетенный рост - знаком "+/-". Если по сравнению с контролем на средах с препаратом наблюдают заметное уменьшение количества колоний на чашках (более 70%) или отсутствие роста тест-микроорганизмов, делают заключение о наличии антимикробного действия.