ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 15 страница

Стандартными образцами при испытании листьев и лекарственных препаратов наперстянки пурпуровой и крупноцветковой, травы, цветков, листьев и лекарственных препаратов служат специально изготовленные спиртовые экстракты наперстянки названных видов, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ.

Стандартными образцами при испытании других лекарственных растений и полученных из них лекарственных препаратов служат индивидуальные кристаллические гликозиды: при испытании лекарственных препаратов наперстянки шерстистой - целанид-стандарт; при испытании травы, лекарственных препаратов горицвета - цимарин-стандарт; при испытании семян и лекарственных препаратов строфанта - строфантин G-стандарт; при испытании травы и семян желтушника серого - эризимин-стандарт.

Биологическую активность стандартных образцов устанавливают на лягушках-самцах (Rana temporaria) массой 28-33 г при подкожном введении в октябре-ноябре (таких лягушек условно называют "стандартными" или "нормальными"), а также на кошках в определенных условиях опыта.

При испытании на лягушках, разведения стандартных образцов подбирают с таким расчетом, чтобы одна лягушачья единица действия (1 ЛЕД) соответствовала дозе стандартного образца, вызывающей в определенных условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства стандартных подопытных лягушек.

Под 1 ЛЕД ландыша или наперстянки подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртового образца, разведенного в 4 раза водой. Неразведенные стандартные образцы наперстянки и ландыша содержат в 1 мл 13,33 ЛЕД.

Под 1 ЛЕД цимарина, целанида подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации:

цимарина 1:13333

целанида 1:5000

Под 1 ЛЕД строфантина G, эризимина подразумевают специфическую биологическую активность 0,4 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации:

строфантина G 1:20000

эризимина 1:25000

При испытании сердечных лекарственных средств на кошках активность ИП выражают в кошачьих единицах действия.

Под одной кошачьей единицей действия (1 КЕД) подразумевают дозу стандартного образца или ИП из расчета на 1 кг массы животного, вызывающую систолическую остановку сердца кошки и устанавливаемую в определенных условиях опыта. Эта доза является смертельной.

Разведения стандартного образца или ИП подбирают с таким расчетом, чтобы 1 КЕД содержалась примерно в 15 мл раствора.

1. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

НА ЛЯГУШКАХ

Отбор лягушек и их содержание

Для опытов пригодны лягушки-самцы видов: травяная (Rana temporaria) массой 28-40 г; водяная - озерная (Rana ridibunda) и прудовая (Rana esculenta) массой 30-70 г.

Лягушек содержат в течение зимы в бассейне с проточной водой, в полутемном помещении при температуре от 3 до 8 град. C.

Сохраняемые зимой в бассейне лягушки могут быть сразу использованы для опыта. Весной и летом свежепойманные лягушки должны быть выдержаны до начала опыта в бассейне с проточной водой в течение 2-3 сут. Температура воды в бассейне в теплое время года не должна превышать 15 град. C. Помещение лаборатории, где проводят биологические испытания, должно быть светлым, но защищенным от попадания прямых солнечных лучей, температура воздуха в нем - 15-22 град. C. В лаборатории должна быть раковина для содержания подопытных лягушек, в которую их помещают за 1-1,5 ч до проведения опыта.

Техника испытания и принцип расчета

Отбирают партию лягушек одного вида, возможно близких друг к другу по массе. Взвешивание животных проводят непосредственно перед опытом с точностью до 0,5 г с отклонениями от средней массы в группе не более чем на +/- 2,5 г: 28-33, 30-35, 35-40 и до 65-70 г.

Лягушек по 5 штук укрепляют на досках брюшком кверху с предельно вытянутыми конечностями, булавки вкалывают в верхнюю часть морды и в суставы передних и задних конечностей.

Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней треугольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сторону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просвечивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже места наложения пинцета, так что образуется узкое поперечное оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким (глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сердечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими надавливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При препарировании следят за тем, чтобы через образованное отверстие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце свободно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное сердце каждые 15-20 мин. смачивают 0,6% раствором натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли на обнаженное сердце).

Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу) или в сердце (в полость желудочка); на водяных - в сердце (в полость желудочка) или в вену; под кожу - только растворы, содержащие гликозиды ландыша.

Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят одинаковые дозы испытуемого раствора.

Испытуемые препараты предварительно разводят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора содержали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц действия лекарственного средства умножают на количество миллилитров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, если в 1 мл препарата "Коргликон раствор 0,06% для инъекций" содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 x 0,3 = 3,99), то препарат следует развести 1:4.

1. Метод испытания при введении под кожу. Растворы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности.

После введения раствора наблюдают за лягушками и определяют наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек данной группы в течение 1 ч, если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета, или в течение 2 ч, если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты строфанта или желтушника. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, продолжают наблюдение еще 10 мин. (при длительности наблюдения 1 ч) и учитывают также количество лягушек, у которых остановка сердца наступила в дополнительное время. Длительность систолической остановки сердца должна быть не менее 15 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 15 мин. после остановки, в расчет не принимают.

В протоколах опытов отмечают время введения ИП и результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое отдельное испытание начинают с определения чувствительности данной партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью нескольким группам лягушек с одинаковой массой тела, по 5 животных в каждой, вводят различные дозы стандартного образца: первой группе - дозу, соответствующую 1 ЛЕД (по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от образца); другим - на 0,05 + 0,1 мл больше. Находят наименьшую дозу стандартного образца, вызывающую остановку сердца у большинства из 5 лягушек. Если остановка наблюдается у всех лягушек, то переходят к испытанию меньшей дозы, а если остановки были у 1 или 2 животных или не наблюдались вообще, то доза ИП увеличивается. Таким образом, определяется чувствительность опытной партии лягушек по сравнению со стандартными лягушками. Затем в тех же условиях опыта группе из 5 лягушек той же партии вводят раствор ИП в дозе, соответствующей найденной наименьшей дозе стандартного образца, и наблюдают за животными в течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какое лекарственное средство испытывается). Если в результате наблюдений будет установлено, что введенная доза недостаточна или слишком велика, дозу увеличивают или уменьшают, причем разница между дозами должна быть не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет найдена наименьшая доза ИП, вызывающая систолическую остановку сердца у большинства из 5 лягушек.

Далее рассчитывают содержание единиц действия (X) в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке ИП.

Для лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов наперстянки, ландыша, горицвета расчет проводят по формуле:

B x K

X = --------,

0,3 x A

где: A - наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора ИП;

B - наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора стандартного образца;

0,3 - доза в миллилитрах, соответствующая 1 ЛЕД;

K - число, обозначающее разведение ИП.

Для лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов строфанта и желтушника расчет проводят по формуле:

B x K

X = --------.

0,4 x A

2. Метод испытания при введении в полость желудочка сердца. Испытуемые растворы, предварительно освобожденные от избытка спирта (не должен превышать 10%) и летучих веществ, в соответствующем разведении вводят лягушкам непосредственно в полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в 5 с, проколов его в момент диастолы тонкой иглой, соединенной со шприцем с делением 0,02 мл. Иглу вынимают из полости желудочка во время систолы, чтобы избежать кровотечения в месте укола.

Для определения наименьшей дозы раствора стандартного образца и ИП травяным лягушкам вводят примерно 0,2 мл лекарственного препарата наперстянки, ландыша, горицвета или 0,3 мл лекарственного препарата строфанта, желтушника. Допустимое отклонение между вводимыми дозами - 0,02 мл.

При определении активности на водяных лягушках рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела. Для того чтобы не рассчитывать каждый раз дозу на введение, предлагается таблица расчетных доз (табл. 30.1). Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.

Таблица 30.1

Дозы в мл, рассчитанные для введения

водяным лягушкам при оценке лекарственных средств,

содержащих сердечные гликозиды, внутрисердечным и

внутривенным путем

Длительность наблюдения за лягушками - 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 5 мин. после остановки, в расчет не принимают.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке испытуемого образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но значения A и B зависят от принципа расчета доз, т.е. от вида применяемых лягушек:

A - наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора ИП;

B - наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора стандартного образца.

3. Метод испытания при введении в вену. У лягушек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней поверхности после отведения в сторону лоскутов кожи с каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее колено петли вены лягушки.

При введении лягушкам внутривенным способом растворов cтандартных образцов и ИП в соответствующем разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих веществ, рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела (табл. 30.1).

Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену одинаковые дозы раствора cтандартного образца или ИП тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл, со скоростью 0,1 мл за 5 с. После каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки - 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин.; о результатах судят по изменениям, наступающим в дополнительное время.

Определение наименьшей дозы стандартного образца и ИП, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства лягушек (не менее 3) из 5, проводят так же, как при введении под кожу. Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки.

Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке ИП по формулам, приведенным для подкожного введения, но с другими обозначениями A и B:

A - наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора ИП;

B - наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора cтандартного образца.

2. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

НА КОШКАХ

Отбор кошек и их содержание

Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беременных и не лактирующих, массой 2,0-3,5 кг, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 2-3 сут. За 16-20 ч до начала опыта животных лишают пищи, но не воды.

Техника испытания и принцип расчета

Опыт проводят под легким наркозом (например, 200-250 мг/кг гексенала в мышцу бедра). В отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю, соединенную тонкой каучуковой трубкой, с градуированной бюреткой вместимостью 50-100 мл, откуда поступает раствор ИП, приготовленный на 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций. На пути между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик, помещенный на водяную баню с температурой 39 град. C для поддержания постоянной температуры (37 град. C) вводимого раствора. В резиновую трубку, соединяющую стеклянный змеевик с канюлей, вставляют с помощью стеклянного тройника термометр, показывающий температуру жидкости, поступающей к животному. Жидкость из бюретки вытекает под постоянным давлением, что достигается введением в бюретку стеклянного капилляра внешним диаметром не более 1 мм, укрепленного при помощи каучуковой пробки в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда Мариотта). Длина капилляра должна быть такова, чтобы его нижний конец доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость вытекания жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима, наложенного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким образом, чтобы в вену животного в 1 мин. поступал 1 мл испытуемого раствора. Можно использовать другое оборудование, позволяющее соблюдать указанную скорость введения и температуру испытуемого раствора. Введение раствора проводят до наступления остановки сердца. Длительность опыта должна составлять не менее 30 и не более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по исчезновению сердечного толчка и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. При наличии патологических изменений в органах опыт в расчет не принимают.

Оценку активности ИП можно проводить двумя способами:

1) по сравнению со стандартным образцом;

2) в кошачьих единицах действия (КЕД).

1. Оценка активности ИП по сравнению со стандартным образцом.

В опыт берут не менее 12 кошек: по 6 животных, как для стандартного образца, так и для ИП. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут. без повторного испытания.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу "Обработка результатов определения биологической активности сердечных гликозидов на кошках" общей фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".

Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если отношение

_

стандартного отклонения среднего результата S_ к средней смертельной дозе y

y

не превышает 5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов.

ИП считают прошедшим испытание, если отношение средних смертельных доз

ИП и стандартного образца составляет 90-110%, а их разность не превышает

величины S x t.

d

2. Определение активности ИП в КЕД. Для выражения активности ИП в кошачьих единицах действия (КЕД) расчет проводят для каждого животного по формуле:

K x m

A = ------,

a

где: K - разведение ИП;

m - масса животного в килограммах;

a - доза разведенного ИП в миллилитрах.

Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД и вычисляют (в КЕД и процентах) отклонения результатов отдельных опытов от среднего числа КЕД.

Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет меньше максимально допустимого отклонения для данного числа опытов, указанного в табл. 30.2.

Таблица 30.2

Максимально допустимое отклонение отдельных опытов

от среднего значения

Из табл. 30.2 следует, что испытания можно проводить на 3 кошках (минимальное число опытов), но только в том случае, если полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4%. В противном случае, число опытов следует увеличить.

Таблица 30.3

Пример расчета: определение числа КЕД для

раствора строфантина K 0,05% для инъекций

Среднее число КЕД = 3,33

31. СТЕРИЛЬНОСТЬ (ОФС 42-0066-07)

Лекарственные средства для инъекций и инфузий, глазные капли, мази, пленки и другие препараты и субстанции, в отношении которых имеются соответствующие указания в документации, должны быть стерильными, то есть не содержать микроорганизмов.

Методы контроля стерильности применяют для испытания всех лекарственных средств независимо от их природы и лекарственной формы.

1. Условия проведения испытания

Испытание на стерильность проводят в асептических условиях, чтобы избежать микробной контаминации во время посева, используя, например, ламинар-бокс класса А, расположенный в зоне класса В, или изолятор. Можно применять и другие меры, предотвращающие контаминацию, при условии, что они не оказывают пагубное влияние на микроорганизмы, которые могут содержаться в исследуемых образцах. Условия проведения испытания регулярно контролируют в соответствии с правилами GMP.

2. Определение антимикробного действия

До проведения испытания на стерильность следует определить, обладает ли исследуемый образец антимикробным действием, которое может существенно повлиять на результаты испытания.

Для этого готовят взвеси культур тест-микроорганизмов (табл. 31.4) с конечной концентрацией не более 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Испытание проводят дважды с каждым микроорганизмом в отдельности.

В пробирки с 10 мл питательной среды, рекомендованной для испытания, вносят по 1 мл приготовленной взвеси тест-микроорганизма.

В две пробирки с инокулированной средой вносят по 1 мл исследуемого образца, в две другие вносят по 1 мл соответствующего растворителя - положительный контроль. Посевы на тиогликолевой среде инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 3-х сут. Посевы на жидкой соево-казеиновой среде и среде Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут.

Сравнивают рост тест-микроорганизмов в контрольных и опытных посевах при визуальном просмотре. Если результаты неодинаковые, то есть, в контроле наблюдают рост тест-микроорганизма, а в опыте рост отсутствует, считают, что исследуемый образец обладает бактериостатическим или фунгистатическим действием.

2.1. Устранение антимикробного действия

При наличии антимикробного действия исследуемого образца используют специфические инактиваторы, указанные в нормативных документах. Например, парааминобензойная кислота для сульфаниламидов, бета-лактамаза для пенициллинов и цефалоспоринов.

Неспецифические инактиваторы (твин-20, твин-80, яичный лецитин, гистидина гидрохлорид, натрия тиосульфат и другие) добавляют в буферный раствор и (или) в питательные среды, как правило, до стерилизации.

Для разведения исследуемого образца перед испытанием на стерильность можно использовать нейтрализующую жидкость, приготовленную в лаборатории или промышленного производства, следующего состава:

Полисорбата-80 (твина-80) - 30,0 г

Лецитина яичного (или соевого) - 3,0 г

L-гистидина гидрохлорида - 1,0 г

Пептона (мясного или казеинового) - 1,0 г

Натрия хлорида - 4,3 г

Калия фосфата однозамещенного - 3,6 г

Натрия фосфата двузамещенного - 7,2 г

Воды - 1000 мл

Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации.

pH после стерилизации 7,0 +/- 0,2.

Если разведение в вышеприведенном растворе не устраняет антимикробное действие исследуемого образца, то увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина. Альтернативно допускается добавление в буферный раствор специфических инактиваторов, устраняющих антимикробное действие лекарственных средств или консервантов (табл. 31.1).

Таблица 31.1

Инактиваторы антимикробного действия консервантов

При отсутствии инактиватора исследуемый образец разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды, или используют метод мембранной фильтрации.

3. Испытание на стерильность

3.1. Отбор образцов для анализа

Для испытания отбирают образцы лекарственного средства в количестве, указанном в табл. 31.2, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Таблица 31.2

Количество единиц (ампул, флаконов и др.) от серии

исследуемого образца для проведения анализа

┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐

│ Количество единиц в серии │ Количество единиц │

│ │ для проведения анализа (не менее) │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤