ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 12 страница

1 мл 1 М раствора натрия гидроксида соответствует 0,1634 г трихлоруксусной кислоты.

Срок годности полученного раствора - 1 год.

Раствор разводят водой до концентрации 20%.

Срок годности 20% раствора трихлоруксусной кислоты - 1 мес.

Метод В (с натрия додецилсульфатом). Определение проводят, как описано в методе А, но вместо 5 мл реактива В к растворам прибавляют по 1 мл щелочного реагента меди.

Примечание. Приготовление щелочного реагента меди. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 0,2 г меди сульфата и 0,4 г натрия тартрата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 1 объем полученного раствора смешивают с 2 объемами 5% раствора натрия додецилсульфата и 1 объемом 3,2% раствора натрия гидроксида.

Срок годности - 2 недели при комнатной температуре.

3. Метод Бредфорда

Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90 с белком при длине волны 595 нм. Связывание красителя происходит в анионной форме преимущественно с остатками аргинина и в меньшей степени с остатками лизина, гистидина, триптофана и фенилаланина белка.

Методика. 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,04-0,05 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорда, тщательно перемешивают и через 10 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорда. Окраска стабильна в течение 1 часа. Для соблюдения линейной зависимости оптической плотности определяемого белка от его концентрации конечная концентрация белка в растворе красителя должна быть 0,008-0,010 мг/мл. В частных фармакопейных статьях допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорда с соблюдением данного условия.

Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному в пределах от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка в 0,1 мл раствора.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечание. Приготовление реактива Бредфорда. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90, растворяют в 25 мл спирта 96%, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.

Реактив хранят при комнатной температуре во флаконе темного стекла. Срок годности - 2 недели.

Перед использованием реактив фильтруют.

Допускается использование коммерческого реактива Бредфорда.

4. Метод с бицинхониновой кислотой

Метод основан на восстановлении двухвалентного иона меди в одновалентный при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса CU+ с бицинхониновой кислотой (2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота-БХК). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть уменьшено разбавлением испытуемого раствора или устранено отделением белка путем его осаждения, описанного в методе Лоури. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, поэтому белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.

Методика. К 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,025-0,05 мг белка; 0,1 мл раствора стандартного образца белка и к 0,1 мл растворителя, используемого для приготовления испытуемого раствора, прибавляют 2 мл реагента меди с БХК. Выдерживают растворы при 37 град. C в течение 30 мин., охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин. (от конца выдержки при 37 град. C) измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Содержание белка в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику.

Примечания

1. Приготовление БХК-реагента. В мерной колбе вместимостью 1 л в воде растворяют 10 г бицинхониновой кислоты (БХК) или ее динатриевой соли, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; pH полученного раствора должен быть 11,25. При необходимости pH доводят раствором натрия гидроксида 10% или натрия гидрокарбоната 5%.

2. Приготовление реагента меди с БХК. Смешивают 1 мл 4% раствора меди сульфата и 50 мл БХК-реагента.

3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО СОДЕРЖАНИЮ АЗОТА

Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25.

Другие азотсодержащие вещества, присутствующие в испытуемом образце, будут оказывать влияние на результаты определения.

Определение белка по содержанию азота основано на разложении испытуемого образца при проведении анализа. При нагревании азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить количественно.

1. Метод Къельдаля

А. Микрометод. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение азота в органических соединениях" (раздел 2 - микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10-20 мг белка.

Б. Метод Къельдаля (обратное титрование). Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение азота в органических соединениях" (раздел 3, подраздел Б - определение азота преимущественно в препаратах крови) из точного объема испытуемого раствора, содержащего 50-200 мг белка.

2. Метод с реактивом Несслера

Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера.

Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом.

Метод А. Точную навеску лекарственного средства, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Къельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5-1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без испытуемого образца.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,03 до 0,07 мг в 25 мл конечного раствора.

Метод Б (с использованием фосфорновольфрамовой кислоты). В центрифужную термостойкую пробирку вместимостью 10 мл вносят от 0,5 до 3 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,07 до 3,0 мг, доводят при необходимости объем 0,9% раствором натрия хлорида до 3 мл, прибавляют 0,3 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты и 0,3 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивают и оставляют на 18-20 ч при температуре 2-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 2000 об/мин. в течение 30 мин. при температуре 4-6 град. C. Осадок промывают смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл серной кислоты концентрированной, 0,1 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты, затем центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком или стеклянной воронкой и минерализуют на песчаной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически прибавляют по 1-2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (8-10 ч или указанного в частной фармакопейной статье времени), окраска которого не изменяется в течение последних 1-1,5 ч. Пробирку охлаждают, доводят объем минерализата водой до 10 мл и перемешивают. 0,5 мл полученного раствора переносят в мерную пробирку, доводят водой до объема 9,5 мл и перемешивают; прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор, приготовленный аналогичным образом из контрольной пробы.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,005 до 0,025 мг в 10 мл и воспроизводят при каждом анализе.

4. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО АМИНОКИСЛОТНОМУ СОСТАВУ

Метод включает кислотный гидролиз (обычно в 6 М растворе хлористоводородной кислоты при 110 град. C в течение 18-72 ч) белков до аминокислот, которые затем хроматографически разделяют в соответствии с инструкцией, прилагаемой к аминокислотному анализатору, и количественно определяют в сравнении со стандартами аминокислот.

Необходимо учитывать, что при кислотном гидролизе разрушается триптофан и частично треонин и серин. Количество треонина и серина определяют путем экстраполяции данных к нулевому времени гидролиза. Пептидная связь между остатками валина, лейцина и изолейцина более устойчива к гидролизу, чем у других аминокислот, поэтому их количество определяют после гидролиза в течение 72 час. При определении цистеина и метионина необходимо их предварительно окислять соответственно в цистеиновую кислоту и метионинсульфон или использовать другие методы анализа: для цистина (1/2 цистеина) - гидразинолиз с последующим проведением цветной реакции с реактивом висмута, описанным в частной фармакопейной статье; для метионина - проведение гидролиза в отдельной навеске большой массы (около 0,5 г) с последующей цветной реакцией с натрия нитропруссидом. Триптофан определяют после щелочного гидролиза в отдельной навеске и проводят цветную реакцию с n-диметиламинобензальдегидом.

Расчет содержания белка проводят следующим образом: зная содержание

каждой аминокислоты (A ) в мкг/мг и мкМ/мг, рассчитывают сумму аминокислот.

i

Затем рассчитывают величину средней молекулярной массы аминокислот (M ),

ср.

поделив сумму аминокислот в мкг (SUM A ) на сумму аминокислот в мкМ :

i1

(SUM A ):

i2

SUM A

i1

M = ----------.

ср. SUM A

i2

Из полученного значения M вычитают 18 (молекулярная масса воды,

ср.

которая присоединяется к пептидной связи во время гидролиза с ее разрывом и

образованием концевых групп аминокислот), получают величину среднего

аминокислотного остатка (A ):

ср.

A = M - 18.

ср. ср.

Затем полученное значение A умножают на сумму аминокислот в мг и

ср.

делят на значение M , в результате получают содержание белка в мг (Б):

ср.

A x SUM A

cp. i1

Б = -----------------,

1000 x М

ср.

где 1000 - перевод мкг в мг.

Для определения содержания белка (X) в мг в 1 мг образца лекарственного средства делят значение Б с учетом разведения (P), проводимого в ходе анализа, на навеску образца (m) в мг, которая обычно составляет около 10 мг:

Б x P

X = -------.

m

20. НИТРИТОМЕТРИЯ (ОФС 42-0054-07)

Нитритометрия - метод титриметрического анализа, при котором в качестве реактива для титрования используется раствор натрия нитрита.

Применяется для количественного определения соединений, содержащих первичную или вторичную ароматическую аминогруппу, для определения гидразидов, а также ароматических нитросоединений после предварительного восстановления нитрогруппы до аминогруппы.

Методика. Если не указано иначе, точную навеску образца лекарственного средства, указанную в частной фармакопейной статье, растворяют в смеси 10 мл воды и 10 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%. Прибавляют воду до общего объема 80 мл, 1 г калия бромида и при постоянном перемешивании титруют 0,1 М раствором натрия нитрита. В начале титрования прибавляют раствор натрия нитрита со скоростью 2 мл/мин., а в конце (за 0,5 мл до эквивалентного количества) - 0,05 мл/мин.

Титрование проводят при температуре раствора 15-20 град. C, однако в некоторых случаях требуется охлаждение до 0-5 град. C.

Точку эквивалентности определяют электрометрическими методами (потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование) или с помощью внутренних индикаторов.

При потенциометрическом титровании в качестве индикаторного применяют платиновый электрод, при этом в качестве электродов сравнения используют хлорсеребряный или насыщенный каломельный электрод.

На электроды накладывают разность потенциалов 0,3-0,4 В, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

В качестве внутренних индикаторов используют тропеолин 00 (4 капли раствора), тропеолин 00 в смеси с метиленовым синим (4 капли раствора тропеолина 00 и 2 капли раствора метиленового синего), нейтральный красный (2 капли в начале и 2 капли в конце титрования).

Титрование с тропеолином 00 проводят до перехода окраски от красной к желтой, со смесью тропеолина 00 с метиленовым синим - от красно-фиолетовой к голубой, с нейтральным красным - от красно-фиолетовой к синей. Выдержку в конце титрования с нейтральным красным увеличивают до 2 мин.

Параллельно проводят контрольный опыт.

ИСПЫТАНИЕ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ

21. ОБЩАЯ ЗОЛА (ОФС 42-0055-07)

Около 1 г испытуемого вещества или 3-5 г измельченного лекарственного растительного сырья (точная навеска) помещают в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель, равномерно распределяя вещество по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревают, давая сначала веществу сгореть или улетучиться при возможно более низкой температуре. Сжигание оставшихся частиц угля проводят также при возможно более низкой температуре; после того как уголь сгорит почти полностью, увеличивают пламя. При неполном сгорании частиц угля остаток охлаждают, смачивают водой или насыщенным раствором аммония нитрата, выпаривают на водяной бане и остаток прокаливают. В случае необходимости такую операцию повторяют несколько раз.

Прокаливание проводят в муфельной печи при температуре около 600 град. C до постоянной массы, избегая появления пламени, сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

22. СУЛЬФАТНАЯ ЗОЛА (ОФС 42-0056-07)

Точную навеску испытуемого вещества (около 1 г, если нет других указаний в частной фармакопейной статье) помещают в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель, смачивают 1 мл серной кислоты концентрированной и осторожно (избегая сильного вспенивания вещества) нагревают на пламени или песчаной бане до удаления паров серной кислоты. Продолжают нагревание при более высокой температуре до исчезновения темных частиц. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при температуре около 600 град. C до постоянной массы, избегая появления пламени, сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

В случае трудного сгорания, прибавление серной кислоты концентрированной и прокаливание повторяют.

23. ОСТАТОЧНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ РАСТВОРИТЕЛИ

(ОФС 42-0057-07)

Остаточные органические растворители - это растворители, которые используются на любой стадии производства лекарственного средства и полностью не удаляются после завершения технологического процесса.

Контролю на содержание органических растворителей подвергаются лекарственные и вспомогательные вещества, а также лекарственные препараты независимо от способа применения, если при их получении или очистке используются органические растворители или они могут образоваться в процессе производства.

Нормативная документация (НД), регламентирующая качество таких лекарственных и вспомогательных веществ, а также лекарственных препаратов, должна иметь раздел "Остаточные органические растворители".

Отсутствие такого раздела в НД должно быть обосновано.

Предельно допустимое содержание органических растворителей в лекарственных средствах определяется степенью их возможного риска для здоровья человека. Эти факторы положены в основу классификации органических растворителей:

1 класс - высокотоксичные растворители (генотоксичные канцерогены), применяемые в фармацевтическом производстве в исключительных случаях, когда нельзя избежать их использования (табл. 23.1);

2 класс - негенотоксичные растворители. Нормирование их в лекарственных средствах обусловлено максимально допустимым количеством, принимаемым в составе суточной дозы лекарственного средства (табл. 23.2);

3 класс - растворители низкой токсичности, содержание которых до 0,5% не требует подтверждения (табл. 23.3). Содержание таких растворителей допускается и в более высоких пределах, если это регламентировано правилами Надлежащей производственной практики или иными стандартами производства.

Определение содержания остаточных органических растворителей может быть осуществлено любыми валидированными методами. Наиболее часто для этих целей используется метод газовой хроматографии.

Содержание остаточных органических растворителей в лекарственных средствах регламентируется следующим образом:

1) при наличии растворителей 1 класса каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно;

2) при наличии растворителей 2 класса каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно;

3) при наличии растворителей 3 класса, если их содержание не превышает 0,5%, для определения допускается применение неспецифического метода "Потеря в массе при высушивании"; при наличии растворителей 3 класса, если их содержание превышает 0,5%, каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно.

Условия проведения анализа на остаточные органические растворители должны быть описаны в соответствующих НД.

Указание на необходимость определения в фармацевтической субстанции или готовой лекарственной форме иных органических растворителей и условия проведения их анализа должны содержаться в соответствующих НД.

Таблица 23.1

Предельно допустимое содержание в лекарственных

средствах остаточных органических растворителей

1 класса токсичности

Таблица 23.2

Предельно допустимое содержание в лекарственных

средствах остаточных органических растворителей

2 класса токсичности

Таблица 23.3

Растворители 3 класса токсичности, которые подлежат

нормированию в соответствии с требованиями

настоящей ОФС

24. ИСПЫТАНИЯ НА ЧИСТОТУ И ДОПУСТИМЫЕ ПРЕДЕЛЫ ПРИМЕСЕЙ

Определение примесей в лекарственных средствах и оценку их содержания проводят путем сравнения с эталонными растворами, устанавливающими предел содержания данной примеси, после проведения реакции. Окраска или опалесценция/муть испытуемого раствора должна быть не интенсивнее окраски или опалесценции/мути эталонного раствора.

Общие замечания

1. Вода и все реактивы должны быть свободны от ионов, на содержание которых проводят испытания.

2. Пробирки, в которых проводят наблюдения, должны быть бесцветными и одинакового диаметра (около 1,5 см, если не указано иначе).

3. Если не указано иначе, навески для приготовления эталонных растворов отвешивают с точностью до 0,001 г.

4. Наблюдения мути и опалесценции растворов проводят в проходящем свете на темном фоне, а окраски - по оси пробирок при дневном отраженном свете на матово-белом фоне.

5. Прибавление реактивов к испытуемому и эталонному растворам должно проводиться одновременно и в одинаковых количествах.

6. В случае, когда в соответствующей фармакопейной статье указано, что в данной концентрации раствора не должно обнаруживаться той или иной примеси, поступают следующим образом. К 10 мл испытуемого раствора прибавляют применяемые для каждой реакции реактивы, указанные в методике, кроме основного реактива, открывающего данную примесь. Затем раствор делят на две равные части: к одной из них прибавляют основной реактив и оба раствора сравнивают между собой. Между ними не должно быть заметной разницы.

24.1. ЖЕЛЕЗО (ОФС 42-0058-07)

Химические методы определения примеси железа в лекарственных средствах основаны на образовании окрашенных растворов при взаимодействии ионов железа с различными реагентами.

С сульфосалициловой кислотой соли двух- и трехвалентного железа в зависимости от концентрации образуют в аммиачной среде желтые или коричнево-красные растворы сульфосалицилатных комплексов (метод 1); в зависимости от природы испытуемого образца используются различные модификации этого метода.

С тиогликолевой кислотой в аммиачной среде (метод 2) или с аммония тиоцианатом в кислой среде (метод 3) соли трехвалентного железа в зависимости от концентрации образуют розовые или красные растворы соответствующих соединений. В этих методах двухвалентное железо переходит в трехвалентное под действием тиогликолевой кислоты или аммония персульфата.

Интенсивность окраски испытуемого раствора сравнивают с окраской эталонного раствора. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать окраску эталонного раствора.

Предельно допустимое содержание солей железа, метод испытания, условия подготовки испытуемого образца и концентрация стандартного раствора железа должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Определение железа в растворах лекарственных средств

Метод 1

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 1 мл 10% раствора аммиака, перемешивают и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Определение солей железа в соединениях магния

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 0,5 мл 10,7% раствора аммония хлорида, 1 мл 10% раствора аммиака и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Определение солей железа в соединениях алюминия

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл). К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 5 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 2 мл 10% раствора натрия гидроксида и сравнивают окраску растворов.

Метод 2

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (1 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 20% раствора лимонной кислоты и 0,1 мл тиогликолевой кислоты, перемешивают, добавляют раствор аммиака до щелочной реакции, разбавляют водой до 20 мл, перемешивают и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Метод 3

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. К 3 мл стандартного раствора железо(III)-иона (1 мкг/мл) прибавляют 7 мл воды.

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 0,5 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 10 мг аммония персульфата и 1,5 мл 15% раствора аммония тиоцианата, перемешивают и сравнивают окраску растворов.

Определение солей железа в зольном остатке

органических соединений

Испытуемый раствор. Зольный остаток, полученный после сжигания навески испытуемого образца с серной кислотой концентрированной, обрабатывают при нагревании на водяной бане 2 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и прибавляют 2 мл воды.

Содержимое тигля, если нужно, фильтруют в пробирку, тигель и фильтр промывают 3 мл воды, присоединяя промывные воды к фильтрату. Раствор нейтрализуют аммиаком водным и доводят объем раствора водой до 10 мл.

Эталонный раствор. В тигель помещают серную кислоту в количестве, взятом для сжигания испытуемого образца, и далее поступают как с испытуемым препаратом, но объем раствора доводят водой до 9 мл, после чего прибавляют 1 мл стандартного раствора железо(III)-иона (30, 10 или 3 мкг/мл в зависимости от метода определения).