ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 11 страница

Таблица 16.4

Эталоны желтых оттенков (шкала Y)

Таблица 16.5

Эталоны зеленовато-желтых оттенков (шкала GY)

Таблица 16.6

Эталоны красных оттенков (шкала R)

Сравнение степени окраски жидкости с эталонами (B, BY, Y, GY, R) обычно проводят по методу I; в случае использования эталонов B4-9, (BY, Y, GY, R)4-7 применяют метод II.

Степень окраски испытуемого раствора не должна превышать степень окраски соответствующего эталона. Цвет испытуемого образца должен быть максимально приближен к цвету соответствующего эталона.

При сравнении окраски испытуемого раствора с эталонами указывают, кроме номера эталона, букву шкалы. Например, окраска раствора не должна превышать эталон B7.

При необходимости могут быть использованы другие эталоны, приготовленные путем смешения стандартных растворов разных цветовых шкал с точным указанием их объемов для достижения нужной окраски, приближенной к окраске испытуемого раствора, если это предусмотрено частной статьей.

Для оценки окраски жидкостей возможно использование спектрофотометрического метода, при этом должны быть указаны: длина волны, при которой наблюдается максимум поглощения в видимой области спектра, толщина кюветы и значение оптической плотности с допустимыми отклонениями, если это предусмотрено частной фармакопейной статьей.

17. ПРОЗРАЧНОСТЬ И СТЕПЕНЬ МУТНОСТИ ЖИДКОСТЕЙ

(ОФС 42-0051-07)

Прозрачность и степень мутности жидкостей определяют путем сравнения испытуемой жидкости с растворителем или эталонами визуально или инструментальным методом.

Испытание проводят в пробирках с притертой пробкой из прозрачного бесцветного стекла с внутренним диаметром около 15 мм. Для сравнения берут равные объемы эталона и испытуемой жидкости (5 или 10 мл). Испытание проводят при освещении электрической лампой матового стекла мощностью 40 Вт, расположенной над образцом, просматривая растворы перпендикулярно вертикальной оси пробирок на черном фоне через 5 мин. после приготовления эталона.

Испытуемую жидкость считают прозрачной, если она по прозрачности не отличается от воды или растворителя, используемого при приготовлении испытуемой жидкости, или выдерживает сравнение с эталоном I, т.е. ее опалесценция (мутность) не превышает опалесценцию (мутность) эталона I при просмотре в описанных выше условиях.

Эталонами служат взвеси из гидразина сульфата и гексаметилентетрамина.

Приготовление раствора гидразина сульфата. 0,50 г гидразина сульфата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор выдерживают в течение 4-6 ч.

Приготовление раствора гексаметилентетрамина. 3,00 г гексаметилентетрамина растворяют в 30,0 мл воды.

Приготовление исходного эталона. К 25,0 мл раствора гидразина сульфата прибавляют 25,0 мл раствора гексаметилентетрамина, перемешивают и оставляют на 24 ч.

Исходный эталон стабилен в течение 2 мес. при хранении в стеклянной посуде, не имеющей дефектов поверхности (взвесь не должна прилипать к стеклу), с притертой пробкой.

Приготовление основного эталона. 15,0 мл исходного эталона помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.

Срок годности основного эталона - 24 ч.

Приготовление эталонов сравнения. Отмеренное количество основного эталона, указанное в приведенной ниже таблице, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.

Таблица 17.1

Состав эталонов сравнения

Примечание. Перед применением исходный, основной и эталоны сравнения перемешивают и встряхивают в течение 3 мин.

Эталоны сравнения I, II, III и IV должны быть свежеприготовленными.

Для оценки прозрачности и степени мутности жидкостей допускается использование специальных приборов типа турбидиметров или эквивалентных, если это предусмотрено частной фармакопейной статьей.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА В ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ

МЕТОДОМ КЪЕЛЬДАЛЯ (ОФС 42-0052-07)

Метод основан на минерализации лекарственного средства под воздействием серной кислоты концентрированной при нагревании в присутствии катализаторов. При этом азот превращается в аммония сульфат. При добавлении натрия гидроксида выделяется аммиак, который перегоняют с паром в приемник, содержащий кислоту для его поглощения: борную - в методе прямого титрования (1 и 2); серную или хлористоводородную - в методе обратного титрования (3). В методах 1 и 2 поглощенный аммиак титруют раствором кислоты (хлористоводородной или серной), в методе 3 избыток кислоты оттитровывают раствором натрия гидроксида. По результатам титрования рассчитывают содержание азота.

Различают следующие варианты метода: 1 - метод Къельдаля, 2 - микрометод Къельдаля, 3 - метод Къельдаля (обратное титрование).

Прибор для определения азота (рис. 18.1 - не приводится) состоит из парообразователя - круглодонной колбы (1) вместимостью 3 л с предохранительной трубкой (2), сменных колб Къельдаля с длинным горлом (3) для конденсации водяных паров и защиты от потери вещества, воронки (4) с зажимом или краном (5) для добавления щелочи, брызгоуловителя (6), прямого холодильника (7) и сменных конических колб-приемников (8). Стеклянная посуда должна быть термостойкой. Прибор помещают в вытяжной шкаф.

Вместо описанного прибора могут быть использованы приборы для автоматического определения азота по Къельдалю. В таком случае определение проводят в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

1. Метод Къельдаля

В колбу Къельдаля (3) вместимостью 200-300 мл (другие объемы от 50 до 500 мл должны быть указаны в частной фармакопейной статье) помещают точную навеску или точный объем образца лекарственного средства (0,5-10,0 мл) с содержанием азота около 14-35 мг (если требуется пробоподготовка, она должна быть описана в частной фармакопейной статье), три стеклянных шарика для пенящихся веществ и 1 г растертой смеси калия сульфата и меди сульфата, взятых в соотношении 10:1 (другой состав смеси катализаторов должен быть указан в частной фармакопейной статье). Для трудно сжигаемых веществ дополнительно в колбу (3) добавляют 0,05 г металлического селена и/или 1 мл водорода пероксида. Прибавляют 7 мл серной кислоты концентрированной и осторожно вращают колбу для стекания кислоты со стенок и ее перемешивания с содержимым колбы. Постепенно нагревают колбу (3), закрытую стеклянной воронкой, на асбестовой сетке над открытым пламенем газовой горелки или в электронагревательном приборе и далее кипятят содержимое в течение нескольких часов до получения раствора светло-зеленого цвета. На стенках колбы не должно оставаться обугленного вещества. Кипячение продолжают еще 30 мин. или более до просветления раствора. Если при кипячении происходит сильное пенообразование, то рекомендуется снять колбу Къельдаля с нагревательного прибора и дать пене осесть, затем снова продолжают нагревание, не допуская попадания пены в горло колбы. После охлаждения колбы Къельдаля в нее осторожно добавляют 20 мл воды, вращая колбу для перемешивания содержимого, вновь охлаждают и присоединяют колбу к собранному аппарату (рис. 18.1), заранее промытому путем пропускания через него пара. В парообразователь наливают воду не менее половины объема, подкисленную 0,5 М или 0,05 М раствором серной кислоты по индикатору метиловому красному (2-3 капли) до слабо-розового цвета, для связывания аммиака, который может попасть из воздуха. Для обеспечения равномерного кипения воды в парообразователь помещают стеклянные шарики. В приемник перед началом отгонки наливают 20 мл 4% раствора борной кислоты и прибавляют 0,25 мл (5 капель) смешанного индикатора. Нижний конец внутренней трубки холодильника должен быть опущен в раствор, находящийся в приемнике. После сборки прибора в холодильник пускают воду и доводят до кипения воду в парообразователе. Затем в колбу (3) из воронки медленно по каплям прибавляют 40 мл 30% раствора натрия гидроксида, следя за тем, чтобы раствор в колбе (3) энергично перемешивался поступающим паром. Для обеспечения большей герметичности прибора в воронке следует оставлять некоторый избыток 30% раствора натрия гидроксида. Собирают около 100 мл отгона (или количество, указанное в частной фармакопейной статье). Во время отгонки колбу Къельдаля нагревают так, чтобы объем жидкости в ней оставался постоянным. По окончании отгонки опускают приемник, трубку холодильника выводят из жидкости, промывают снаружи водой, продолжая подачу пара в колбу (3) в течение 1-2 мин.; промывную воду собирают в тот же приемник. После этого прекращают нагревание парообразователя и немедленно отсоединяют колбу Къельдаля от прибора. По окончании отгонки дистиллят титруют 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или 0,05 М раствором серной кислоты (должно быть указано в частной фармакопейной статье) до перехода окраски смешанного индикатора из зеленой в красно-фиолетовую.

Проводят контрольный опыт таким же образом и с теми же реактивами, но без испытуемого образца; полученный результат используют для внесения поправки при расчете содержания азота.

1 мл 0,1 М раствора хлористоводородной или 0,05 М раствора серной кислоты соответствует 1,401 мг азота.

2. Микрометод Къельдаля

В колбу Къельдаля вместимостью от 50 до 250 мл помещают точную навеску или указанный в частной фармакопейной статье объем образца лекарственного средства с содержанием азота 1,4-3,5 мг. Остальные операции проводят, как указано выше в методе 1, используя описанную ранее смесь катализаторов или (например, в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами) 0,25 г смеси калия сульфата, меди сульфата и натрия селената в соотношении 20:5:8,5; в этом случае вместо 7 мл прибавляют 2 мл серной кислоты концентрированной.

В случае указанных лекарственных средств минерализацию проводят до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. После этого нагревание продолжают еще 30 мин. В конце минерализации, когда вода испарится, прибавляют 1-3 капли водорода пероксида и продолжают нагревание в течение 10 мин. до обесцвечивания раствора.

Титрование выделенного аммиака проводят 0,01 М раствором хлористоводородной или 0,005 М раствором серной кислоты.

1 мл 0,01 М раствора хлористоводородной или 0,005 М раствора серной кислоты соответствует 0,1401 мг азота.

3. Метод Къельдаля (обратное титрование)

А. После разложения образца лекарственного средства в методах 1 или 2 в приемник помещают точно отмеренное количество (от 10,0 до 25,0 мл) взятой в избытке хлористоводородной или серной кислоты (объем и молярность раствора кислоты зависят от содержания азота в препарате; указывают в частной фармакопейной статье).

По окончании отгонки аммиака содержимое приемника титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида (или 0,01 М, что должно быть указано в частной фармакопейной статье) в присутствии смешанного индикатора, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, до перехода окраски из красно-фиолетовой в зеленую.

Проводят контрольный опыт таким же образом и с теми же реактивами, но без испытуемого образца или используя 0,050 г глюкозы, о чем указывают в частной фармакопейной статье.

Содержание азота в лекарственном средстве в процентах (X ) или в мг/мл

(X ) вычисляют по формулам: 1

-3

(V - V ) x K x 1,401 x 10 x 100

0 1

X = -----------------------------------,

1 m

(V - V ) x K x 1,401

0 1

X = ----------------------,

2 V

где:

V - объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедший на титрование

контрольного раствора, мл;

V - объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедший на титрование

испытуемого раствора, мл;

K - поправочный коэффициент раствора натрия гидроксида;

1,401 - титр азота по соответствующей методике, мг/мл;

m - навеска образца лекарственного средства, г;

V - объем раствора, взятый для анализа, мл.

Б. Данный метод применяют преимущественно в препаратах крови.

В колбу Къельдаля с помощью калиброванной пипетки вносят 0,5-1 мл испытуемого раствора, содержащего 8-32 мг азота (или 50-200 мг белка), затем вносят растертую смесь (около 1 г) калия сульфата и меди сульфата (3:1) и от 2 до 4 мл серной кислоты концентрированной в зависимости от содержания белка. Содержимое колбы кипятят. Для ускорения сжигания несколько раз прибавляют по 5 капель пергидроля и продолжают кипятить, пока раствор не станет голубым или бесцветным. По окончании сжигания смесь охлаждают. В парообразователь наливают воду, нагревают до кипения и проверяют аппарат на герметичность. Присоединяют колбу Къельдаля к прибору для перегонки аммиака или количественно переносят содержимое колбы в реакционный сосуд аппарата, используя 30 мл воды. Отгон собирают в приемник, куда предварительно наливают от 10,0 до 25,0 мл 0,05 М раствора серной кислоты в зависимости от содержания белка. Приемник присоединяют так, чтобы нижний конец трубки холодильника был опущен в раствор. Воду в парообразователе нагревают до кипения. В колбу или в реакционный сосуд аппарата с минерализатом через воронку прибавляют около 20 мл 15 М раствора натрия гидроксида до появления коричневой окраски минерализата. После этого быстро и герметично закрывают зажим воронки и отгоняют аммиак в течение 5 мин. Затем опускают приемник с 0,05 М раствором серной кислоты так, чтобы нижний конец трубки холодильника не касался поверхности жидкости, и продолжают перегонку еще 5 мин. Отгон титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до перехода сиреневой окраски в зеленую (индикатор - 0,05 мл смешанного индикатора). Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида соответствует 1,401 мг азота.

Рис. 18.1. Прибор для определения азота

(объяснение в тексте)

Рисунок не приводится.

19. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА (ОФС 42-0053-07)

Определение содержания белка проводят в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами.

Для лекарственных средств, в которых белки не являются основными компонентами или имеют необычную первичную структуру (например, протамины), могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в частных фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами лекарственного средства.

Для количественного определения белка используют следующие методы:

1. Спектрофотометрические методы, в которых измерение проводят при одной длине волны (метод А) или при двух длинах волн (метод Б). Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении светопоглощения растворов белков при 280 нм (поглощение ароматических аминокислот) или в области 205-220 нм (поглощение пептидных групп).

2. Колориметрические методы

1. Метод с биуретовым реактивом. Метод универсален, мало зависит от природы белка, но имеет низкую чувствительность.

2. Метод Лоури. Преимущественно используется для ферментных препаратов. Отличается высокой чувствительностью, но определению мешают многие вещества. В последнем случае применяют метод с предварительным осаждением белка (Б). Зависимость поглощения белка от его концентрации нелинейная, однако, в области малых концентраций ее можно считать линейной. Определение проводят по калибровочному графику, построенному по растворам стандартного образца белка, который воспроизводят при каждом анализе.

3. Метод Бредфорда используется для белков и пептидов с молекулярной массой более 3000 Да. Метод имеет высокую чувствительность, но степень связывания красителя в значительной степени зависит от индивидуальных свойств белка.

4. Метод с бицинхониновой кислотой альтернативен методу Лоури, но отличается более высокой стабильностью реагента, чем реактив Фолина, и меньшей зависимостью от природы белка и сопутствующих соединений.

Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в частной фармакопейной статье: в эксикаторе под вакуумом над фосфора(V) оксидом, в вакуумном шкафу при 60 град. C или в термостате при 100-105 град. C).

Раствор стандартного образца. Стандартный образец белка растворяют в том же растворителе и в той же концентрации, что и в испытуемом растворе.

Испытуемый раствор. Растворяют или разводят лекарственное средство в воде, 0,9% растворе натрия хлорида или буферном растворе до концентрации, указанной в частной фармакопейной статье.

3. Методы определения белка по содержанию азота

1. Метод Къельдаля - титриметрический (А - микрометод, Б - обратное титрование).

2. Метод с реактивом Несслера (колориметрический). В качестве стандартного образца, содержащего азот, используют аммония сульфат.

Для многокомпонентных препаратов, содержащих другие вещества, в состав которых входит азот, перед определением белка необходимо предварительно проводить пробоподготовку: осаждение трихлоруксусной или фосфорновольфрамовой кислотой.

4. Метод определения белка по аминокислотному составу.

1. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Результаты достоверны в области линейной зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка.

Метод А. Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина) в молекуле белка поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны около 280 нм.

При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам; в этом случае в раствор препарата добавляют неионный детергент, указанный в частной фармакопейной статье, или предварительно концентрируют испытуемый раствор, избегая денатурации белка.

Готовят испытуемый раствор с содержанием белка 0,2-2 мг/мл.

Методика. Выдерживают при комнатной температуре испытуемый раствор, раствор стандартного образца и раствор сравнения в течение 10 мин.

Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения.

Рассеяние света. Точность определения содержания белка в УФ-области уменьшается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250-300 нм). Рассеяние светового луча приводит к увеличению поглощения испытуемого раствора, поэтому дополнительно вычисляют оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм, обусловленную рассеянием света. С этой целью проводят определение оптической плотности испытуемого раствора при длинах волн 320, 325, 330, 335, 340 и 350 нм. Строят график зависимости логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую до lg 280 нм и определяют lg оптической плотности. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света, которое вычитают из оптической плотности раствора, полученной при 280 нм, для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе.

Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле:

C = C x A/A ,

ст. ст.

где:

C - концентрация белка в растворе стандартного образца, в мг/мл;

ст.

A и A - значения оптической плотности испытуемого раствора и

ст.

раствора стандартного образца при длине волны 280 нм соответственно,

после вычитания оптической плотности за счет рассеяния света.

Мутные растворы для уменьшения светового рассеяния перед определением содержания белка фильтруют через фильтры из поливинилиденфторида или указанные в частной фармакопейной статье с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующие белок, или центрифугируют.

Метод Б. Метод измерения оптической плотности растворов при двух длинах волн используют как для растворов чистых белков, так и для их смесей, в области концентраций 0,0015-0,0450 мг/мл, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

Готовят серию разведений (не менее трех) образца лекарственного

средства с равными интервалами и измеряют оптическую плотность полученных

растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм. Концентрацию белка (C ) в каждом

i

растворе в мг/мл вычисляют по формуле:

C = (A215 - A225) x P x 0,144,

i i

где:

A215 и A225 - оптическая плотность разведенного раствора при 215 нм

и 225 нм соответственно;

P - разведение;

i

0,144 - эмпирически вычисленный коэффициент для белков при измерении

оптической плотности растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм.

Рассчитывают среднее значение.

2. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Метод с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.

Методика. К 1 мл испытуемого раствора, приготовленного растворением испытуемого вещества в 0,9% растворе натрия хлорида, с содержанием белка от 2 до 8 мг прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм (или указанной в частной фармакопейной статье, в пределах 540-650 нм).

Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно-аммиачных комплексов, а также с растворами, в которых появляется мутность или образуется осадок. Для устранения влияния посторонних веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объема 50% раствора трихлоруксусной кислоты, удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.

Метод может использоваться в различных вариантах: с построением калибровочной кривой или с использованием стандартного образца.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

2. Метод Лоури

Метод основан на биуретовой реакции белков с солями меди(II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (или реактива Фолина) в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка (главным образом тирозина, а также триптофана и фенилаланина и в меньшей степени цистеина). Развитие окраски достигает максимума через 20-30 мин. при комнатной температуре, в дальнейшем идет уменьшение ее интенсивности. Степень окрашивания зависит от природы белка. Определению мешают некоторые соли, тиоловые соединения, углеводы, липиды, неионные детергенты, органические растворители, комплексоны и другие соединения. Для уменьшения влияния веществ, мешающих определению, проводят дополнительное разведение раствора или осаждение белков трихлоруксусной кислотой.

Метод А (без предварительного осаждения белка). К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,020-0,100 мг белка; к 1 мл каждого раствора стандартного образца белка и к 1 мл используемого для приготовления испытуемого раствора растворителя, помещенным в отдельные пробирки, прибавляют по 5 мл реактива B. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку прибавляют 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива, разбавленного перед употреблением водой в 2 раза, быстро и тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Примечания

1. Приготовление реактива А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 г натрия карбоната, растворяют в 0,1 М растворе натрия гидроксида и доводят объем до метки этим же раствором.

Срок годности раствора - 1 мес.

2. Приготовление реактива Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г меди сульфата и растворяют в 1% растворе: калия-натрия тартрата, или натрия тартрата, или натрия цитрата (должно быть указано в частной фармакопейной статье).

Срок годности раствора - 2 мес.

3. Приготовление реактива В. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива Б.

Метод Б (с предварительным осаждением белка). Метод рекомендован для лекарственных средств, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа (фенол, ароматические аминокислоты, трис-буфер, цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота, этилендиаминтетраацетат; тритон X-100, твин-20, соли, сахара и др.).

Методика. В центрифужную пробирку помещают 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,10-0,30 мг белка, прибавляют 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18-20 ч при температуре 4-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин. при температуре около 5 град. C и скорости вращения 2000 об/мин., промывают 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют в тех же условиях. Осторожно сливают надосадочную жидкость, оставшийся осадок растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой до 1 мл. К 0,5 мл полученного раствора, содержащего 0,050-0,150 мг белка, прибавляют 0,5 мл воды, перемешивают, вносят 5 мл реактива В и далее поступают, как описано выше в методе А.

В качестве раствора сравнения используют пробу, содержащую 0,1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 0,9 мл воды, 5 мл реактива В и 0,5 мл разбавленного в 2 раза фосфорномолибденово-вольфрамового реактива.

Примечание. Приготовление 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 150 г ТХУ растворяют в 100 мл воды. 1 мл полученного раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида с индикатором фенолфталеин и рассчитывают концентрацию трихлоруксусной кислоты в полученном растворе (приблизительно 80% раствор трихлоруксусной кислоты).