Методы определения билирубина и его метаболитов
Определение билирубина в сыворотке крови
В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови. Наиболее распространенным из них является метод Ендрашика-Грофа. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом, тогда как реакция свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значительно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрашика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотоколориметре.
Ход работы:
В 2 пробирки вносится по 0,5 мл сыворотки крови, разведенной 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1. В одну пробирку (определение прямого билирубина) добавляется 1,75 мл 0,9% раствора NаСl и 0,25 мл диазореактива Эрлиха. Во вторую пробирку добавляется 1,75 мл кофеинового реактива и 0,25 мл диазореактива Эрлиха (определение общего билирубина). Обе пробирки встряхиваются и оставляются на 20 мин при комнатной температуре.
Измеряется оптическая плотность проб в 1 и 2 пробирках на ФЭКе при зеленом светофильтре против воды в кюветах, толщиной 5 мм. Если окрашивание в пробах очень слабое, в пробирки добавляется по 3 капли 30% рствора NаОН. Содержание общего (пробирка N2) и прямого (пробирка N 1) билирубина рассчитвается по калибровочному графику.
Для построения калибровочного графика используются рабочие стандартные растворы билирубина, которые готовятся согласно данным таблицы:
| N п/п | Рабочий стандарт раствор билирубина (мл) | Физ- раствор (мл) | мг билирубина в пробе 0,5 мл | Концентрация билирубина в крови (ммоль/ л) |
| 0,05 | 0,45 | 0,005 | ||
| 0,10 | 0,40 | 0,010 | ||
| 0,15 | 0,35 | 0,015 | ||
| 0,20 | 0,30 | 0,020 | ||
| 0,25 | 0,25 | 0,025 |
Стандартные пробы обрабатываются так же, как и опытные. При построения калибровочной кривой на оси ординат откладываются значения оптической плотности, а абсцисс – концентрация билирубина.
Разница между общим и прямым билирубином - непрямой билирубин сыворотки крови.
В норме в сыворотке крови содержится 8,5–20,5 мкмоль/л общего билирубина, причем на долю свободного («непрямого») билирубина приходится около 75% билирубина (до 16,5 мкмоль/л).
Дата добавления: 2016-03-05; просмотров: 3270;