Определение содержания железа в сыворотке крови

Железо вступает в реакцию с бато-фенантролином с образованием окрашенного комплексного соединения. Интенсивность развивающейся окраски пропорциональна концентрации свободного железа в исследуемой пробе.

Ход работы:

В пробирку вносится 2 мл сыворотки крови, 2,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты. Проба интенсивно перемешивается и помещается на 15 минут на водяную баню с температурой 90 – 95 ^оС. После извлечения из водяной бани проба центрифугируется при 2000 об/мин в течение 20 минут. 4 мл верхнего слоя переносится в новую пробирку. Сюда же добавляется 0,35 мл раствора ацетата аммония и 0,3 мл насыщенного раствора гидразина сульфата. После этого проводится измерение оптической плотности на ФЭКе с зеленым светофильтром (535 нм) в кювете толщиной 1 см. Далее, исследуемый раствор переливается в чистую пробирку и к нему прибавляется 0,4 мл раствора бато-фенантролина. Через 40 минут повторно определяется оптическая плотность.

Параллельно ставятся контрольная и стандартная пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирке смешивается 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 3 мл воды, 0,35 мл раствора ацетата аммония и 0,3 мл насыщенного раствора гидразина сульфата. Определяется оптическая плотность в кювете толщиной 1 см. После этого исследуемый раствор переливается в пробирку и к нему прибавляется 0,4 мл раствора бато-фенантролина. Через 40 минут повторно определяется оптическая плотность пробы.

Для приготовления стандартной пробы к 2 мл рабочего стандартного раствора (с концентрацией железа 2 мкг/мл) добавляется 1 мл дистиллированной воды, 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 3 мл воды, 0,35 мл раствора ацетата аммония и 0,3 мл насыщенного раствора гидразина сульфата. Определяется оптическая плотность в кювете толщиной 1 см. После этого исследуемый раствор переливается в пробирку и к нему прибавляется 0,4 мл раствора бато-фенантролина. Через 40 минут повторно определяется оптическая плотность.

Концентрация железа в сыворотке крови рассчитывается по формуле:

(Аоп – Ак) мкг железа в 100 мл

Аст – Ак) ∙300

Где:

Аоп – разность между первым и вторым показанием оптической плотности опытной пробы;

Ак – разность между первым и вторым показанием оптической плотности контрольной пробы;

Аст – разность между первым и вторым показанием оптической плотности стандартной пробы;

Для пересчета содержания железа в мкмоль/л, полученное при расчете по указанной формуле значение умножается на коэффициент 0,179.

В норме содержание железа в сыворотке крови находится в пределах от 12,5 до 30,4 мкмоль/л. У женщин величина этого показателя несколько ниже, чем у мужчин. Величина показателя может значительно понижаться у больных с железодефицитной анемией.

Приготовление реактивов:

1. Раствор сульфата аммония: 70 г ацетата натрия растворяется в 30 мл воды.

2. Насыщенный раствор гидразина сульфата готовится путем смешивания 2,5 г этой соли со 100 мл воды.

3. Раствор бато-фенантролина: 100 мг бато-фенантролина помещается в пробирку с 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты. Смесь кипятится 30 секунд, после чего охлаждается и к ней добавляется 10 мл воды. После 20-минутного нагревания на кипящей водяной бане смесь переносится в 200 миллилитровую колбу, в которую приливается 100 мл воды. Значение рН приготовленного раствора доводится до 4 путем добавления 20% едкого натрия. Общий объем реактива доводится до 200 мл водой.

4. Стандартный раствор железа (100 мкг/мл, 1,8 ммоль/л). 0,7 г соли Мора растворяется в 5 мл 0,3 н раствора соляной кислоты. Объем раствора доводится до 1 л. Рабочий стандартный раствор (2 мкг/мл, 35,8 мкмоль/л) готовится путем разведения основного стандартного раствора подкисленной водой (подкисление проводится при помощи серной кислоты из фиксанала из расчета 1 мл кислоты на 1 л воды).