ГРАДИЕНТ ПОРИСТОСТИ ПААГ

В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько
примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь
рассмотрим возможности этого метода подробнее.

Техника приготовлений гелей с изменяющимися вдоль на-
правления миграции белков размерами пор, или, как их назы-
вают, «градиентов пористости ПААГ», была подробно описана
в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль
градиента достигается путем увеличения концентрации акрил-
амида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет це-
лый ряд существенных преимуществ.

Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков
в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые
зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель
усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков
достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их
может практически прекратиться. Для разных зон этот момент
наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны
мигрируют до своего конечного положения, соответствующего их
размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положе-
ния, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для бел-
ков разной величины конечные положения окажутся в разных
участках градиента пористости. К моменту окончания процесса
фракционирования в целом все белковые зоны займут свои ста-
ционарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет
включено электрическое напряжение. Таким образом, экспери-
ментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза.
Его продолжительность можно выбрать «с запасом», например
поставить опыт на ночь.

Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное
сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в пе-
редней части каждой зоны постоянно оказываются в области
чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны.
Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем не-
много сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот
процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедитель-
ная иллюстрация эффективности такого противодействия была
приведена выше (см. рис. 16).

При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает
необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести
электрофорез в простой непрерывной системе и не очень забо-
титься об объеме исходного препарата. Сделанное замечание
находится в противоречии с цитированными выше недавними
работами, где градиентный гель использовали в сочетании со
ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при та-
ком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но
не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обус-
ловлено определенным консерватизмом и «перестраховкой».

По существу, картина разделения белковых зон при электро-
форезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соот-
ношения размеров белков в препарате и характера градиента
пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофо-
реза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно

использовать любые буферы сравнительно малой концентра-
ции (0,03—0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака
заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что
для данного метода немаловажно, так как скорости миграции
белков при приближении к конечным положениям существенно
уменьшаются.

Указанные преимущества объясняют растущую популяр-
ность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их
приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, '
почему такая ведущая фирма, как «Pharmacia», специализиро-
валась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ.
Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами
78х78х2,7 мм для двух интервалов концентраций ПААГ: 2—
16% и 4—30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента по-
ристости в этих пластинах подобран так, что в пределах некото-
рого диапазона- молекулярных масс нативных глобулярных бел-
ков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миг-
рации белка (до конечного положения) от логарифма его моле-
кулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой
к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий
фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс та-
ковы: для РАА 2/16—от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА
4/30 — от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это озна-
чает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с мо-
лекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имею-
щие массу более 2 млн.—не войдут в него. Последняя цифра
может относиться, конечно, только к белковым комплексам или
нуклеиновым кислотам.

Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, поль-
зоваться и для разделения комплексов белок—ДДС-Na. Ламбен
обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный
градиент концентрации ПААГ в интервале 3—30% позволяет
проводить электрофорез до полной обстановки белков с молеку-
лярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо
следующее линейное соотношение: lg M = A lg T+B, где М—
молекулярная масса белка, а Т—концентрация ПААГ в месте
расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта
концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от нача-
ла пластины. А и В—коэффициенты, указывающие на линей-
ный характер зависимости. Определять их нет нужды, если име-
ется возможность воспользоваться, как обычно, набором мар-
керных белков. Обработку исходного препарата можно прово-
дить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ
с ДДС-Na [Lambin, 1978].

Недавно Ламбен и Фаин [Lambin, Fine, 1979] предложили
способ определения молекулярной массы нативных белков (без
ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте кон-
центрации ПААГ (3—20%). Оказалось, что для любого белка
характер его непрерывно замедляющегося движения в таком

геле хорошо описывается линейной зависимостью: Ö t=aD+b,
где t—любой момент времени с начала электрофореза, пока
белок еще движется; D—пройденное им к этому моменту рас-
стояние в геле; а и b — постоянные в данном опыте величины.

Для каждого конкретного белка такую зависимость легко
получить экспериментально. Удобно, например, в разные карма-
ны одной пластины геля последовательно, через известные про--
межутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого
белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на
пластине будет известна продолжительность электрофореза, а
расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже
для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точ-
кам строят график зависимости Ö t от D, имеющий вид прямой
линии. Тангенс угла наклона этой прямой—значение коэффи-
циента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-
циент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он
крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что
соотношение между логарифмами коэффициента а и молеку-
лярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный ха-
рактер в широком интервале молекулярных масс—от 20 до
950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном урав-
нении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для
трех стандартных буферов: фосфатного (рН 7,2), Трис-боратно-
го (рН 8,2) и Трис-барбитуратного (рН 9,8). Так, для 0,01 М
Na-фосфатного буфера (рН 7,2) имеет место зависимость:

Lg M = l,93 lg a + 6,99. Точность определения молекулярной мас-
сы невысока—в среднем ±20%. Однако важное достоинство
метода состоит в возможности оценивать суммарную молеку-
лярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссо-
циируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя
результаты определения молекулярной массы некоего белка
описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с
использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строе-
ние белка.

В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хо-
рош только для разделения белков по размерам. В случае раз-
деления по заряду он может даже ухудшить результат, так как
белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров
при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же
месте.