Проведение электрофореза

Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего
напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то
здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве-
дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро-
водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро-
форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за
собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень
сильно зависит от температуры). При длительном электрофоре-
зе электродные буферы следует обновлять.

Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение
ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным
даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные
различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо-
действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности
определения молекулярной массы малых белков и олигопепти-
дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М
мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля.
В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви-
ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов
с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая
линейная зависимость lg M от R_f [Kato et al., 1975], однако точки
для инсулина (М=5782) и глюкагона (M = 3483) из графика
этой зависимости выпадали.

Разделение улучшается в случае малых исходных количеств
белка (1 — 5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око-
ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного
белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот-
ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует
поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения
молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге-
лях с различным содержанием акриламида.

В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список
около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка-

честве стандартных маркеров в интервале М 12 — 200 тыс. даль-
тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно
при М > 70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому
фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке-
ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на
основе только одного белка с хорошо известным значением М,
сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров
обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое
время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971].
Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан-
зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик-
сировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.

При определении молекулярной массы коллагена использо-
вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том
случае, если строить график зависимости от расстояния мигра-
ции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп-
тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско-
рость миграции зависит именно от размера молекулы белка —
переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее
значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав
коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици-
на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].