Подготовка белкового препарата

На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопо-
ставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции
можно только в том случае, когда есть уверенность в полной де-
натурации белка при обработке его ДДС-Na.

Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор
процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против
0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% b-мер-
каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации
ДДС-Na и b-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и
прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация
белка при этом должна составлять около 1 мг/мл [Weber et al.,
1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз,
прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что
трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитиче-
скую активность в .присутствии 1% ДДС-Na, но прогрев при
100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Рог-
tci, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюда-
ется неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100°
можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нане-
сением препарата на гель в него дополнительно добавляют b-
меркаптоэтанол до концентрации 4 — 5%.

Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода
рекомендуют при определении молекулярной массы малоизу-
ченного белка проверить полноту его денатурации. Для этой це-
ли они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка
по более сложной прописи, гарантирующей его полную денату-
рацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный b-меркаптоэтанол с по-
следующим алкилированием йодацетамидом). После этого фор-
мируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют картины
электрофореза белка, обработанного обычным способом, и кон-
трольного препарата.

С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи-
ды, при кипячении с 1 % ДДС-Na и 1 % b-меркаптоэтанола мо-
гут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях прихо-
дится уменьшать концентрацию b-меркаптоэтанола или не вво-
дить его совсем.

При повышенной температуре иногда обнаруживается уси-
ленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация
белка многократно увеличивает его доступность для атаки про-
теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эф-
фективных ингибиторов. Если опасность протеолиза существу-
ет, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные
ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).