Тритон Х-100

Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло-
хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за-
частую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от
мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются
вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их
биологическая активность.

Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел-
ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в
1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали
с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном
буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на
формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел-
ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость
белка, однако разделение полос оказывается более надежным,
если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро-
вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко-
торый приходится дольше отмывать.

Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо-
вать не только для растворения, но и для фракционирования
белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел-
ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ-
ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут
связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо-
лекулу (родопсин—до 70). Это дает прирост эффективной мо-
лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон
(молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост
легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.

В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел-
ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра-
ции 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5%
(b-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли
Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков
из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос
в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно
вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде-
ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона
Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про-
цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и
мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь-
но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного
ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус-
ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100.
Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ
со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-

ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног-
да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер-
жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо-
дится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного
ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за
счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима-
ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его
сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства
силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек-
тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло-
ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл
протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мо-
чевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поме-
няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после
этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при по-
стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр-
ности напряжения (белки мигрируют к катоду).

В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель-
ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-
li и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву-
мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при-
сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна-
чала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М
Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это-
го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро-
фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез
позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним
только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви-
ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.

Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в
5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви-
ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {b-це-
пей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура-
цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (b-мер-
каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять
гидрофобные свойства белка.

Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле,
полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона
Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре-
электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином.
В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гисто-
нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе-
ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М
мочевины.

Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100
использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-
ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по-
этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком-
плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-

мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны
мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри-
босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%-
ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз-
личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков.
ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от-
носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,.
отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].

Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий
комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле-
ний, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar-
nird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977].
В последние годы описано применение в тех же целях других,
сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после
обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ-
ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в
0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы
«Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А
печени и других органов мыши при этом удалось разделить на
два компонента, гистон НЗ—на три или четыре; в ряде случа-
ев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979]
был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-
ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М
мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+
+Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ-
лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.