ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ

Обнаружение и локализацию белковых зон после их разде-
ления электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуще-
ствляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как ок-
рашенные полоски или пятна различной интенсивности, в
зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вы-
мачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь
него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как
правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания
полос за это время белки иногда предварительно фиксируют
осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или
50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию сов-
мещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси
уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.

Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам
гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера ге-
ля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции
его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно
менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без
особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачи-
ванием его в относительно большом объеме растворителяс не-

сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффу-
зии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее
ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных
белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто .в
смеси с метанолом, который улучшает растворимость красите-
ля. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37—
50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опас-
ность ослабления окраски полос.

Все типы обычно используемых красителей для белков несут
на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-

Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]

мывкугеля можно еще ускорить, если в растворителе суспенди-
ровать немного ионообменной смолы, связывающей краситель
и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто исполь-
зуют для этой цели смолу смешанного типа AG 501х8.

Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков ми-
нут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле
накладывают на гель в поперечном направлении — перпенди-
кулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с
белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро
выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специ-
альный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электро-
фореза. Такие приборы («дестейнеры») имеются в продаже, но
их легко изготовить и в лаборатории.

Простое устройство для этой цели описано и схематически
изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержа-
веющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смо-
ченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в
ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже
верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля
кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смочен-
ной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюми-
ниевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом.
К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от
источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфора-
ции в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Че-
рез пластину геля размером 12х7х0,3 см нужно пропускать
ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15—20 мин. Находящиеся в

осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непро-
должительном поперечном электрофорезе остаются на своих ме-
стах в геле.

До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если
в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологи-
ческой активности, то их локализацию в геле можно осуществить
с помощью специфической ферментативной реакции или цепи
реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вы-
мачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется,
фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и прихо-
дится мириться с некоторым размыванием белковых полос.
Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффунди-
руют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красите-
лей, и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.

Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миг-
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную
смесь белков можно окрасить красителем «Remazol» [Griffith,
1972], который ковалентно связывается с белком и мигрирует
вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в
присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг бел-
ка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCI с 0,2 М NazHPt^ и 10%
ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогре-
вают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного кра-
сителя белок переосаждают ацетоном.

Чувствительность окрашивания белков многократно увеличи-
вается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных
красителей. Многие из них связываются с белками или пептида-
ми, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно
использовать для наблюдения за ходом электрофореза после
предварительной обработки исходного препарата.

Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные
марки красителей и особенности их применения.