Работа 2. Зависимость скорости реакции от количества фермента.
Метод основан на определении скорости гидролиза крахмала, выявляемого пробой с йодом, в зависимости от количества добавленной амилазы слюны.
Ход определения: Разводят исходную разбавленную слюну водой в пробирках в 20, 40, 80, 160 раз. Берут четыре пробирки и вносят в каждую по 1 мл одного из разбавлений слюны. В пробирках из бюретки добавляют по 4 мл раствора крахмала, быстро помещают в водяную баню при 38 о С и засекают время начала реакции.
Через каждые 1 – 2 мин. отбирают по 2 капли жидкости из каждой пробирки и приливают к ним по 1 капле раствора йода в йодиде калия. В начале пробы дают синее, затем красно – фиолетовое и наконец красное окрашивание.
Отмечают с точностью до 0,5 мин. времени от начала опыта до появления в каждой из четырех пробирок красного окрашивания – стадия образования эритродекстринов из крахмала.
Работа 3. Действие неконкурентных ингибиторов на сукцинатдегидрогеназу.
Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини
/ МС / - как акцептора атомов водорода в присутствии и отсутствии малоновой кислоты.
Образующийся ФАДН2 восстанавливается МС / МСН2 /, в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности синего окрашивание с пробами, содержащими разное количества малоновой кислоты делают вывод о типе действия её на фермент.
В три пробирки помещают по 3 – 4 мл мышечной кашицы и добавляют в первую 0,8 мл воды, во вторую – 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0.5 мл воды, в третью – 0,8 мл раствора малоновой кислоты. Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленовой сини и после перемешивания по 3 – 4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водянную баню при 37оС. Через 3 -5 мин. наблюдают обесцвечивание раствора.
Сравнивают интенсивность голубого окрашивания в трех пробирках и делают вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.
Дата добавления: 2015-09-11; просмотров: 633;