ФЕРМЕНТЫ
Ферменты – это каталитически активные белки. Как и химические катализаторы неорганической природы, они ускоряют химические реакции. В ходе реакции они претерпевают изменения, но по ее завершении возвращаются в исходное состояние. Ферменты не инициируют химические реакции, а только изменяют скорость их протекания. Они катализируют только энергетически возможные реакции. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами. Организованная последовательность процессов обмена веществ возможна при условии, что каждая клетка обеспечена собственным генетически заданным набором ферментов.
По строению ферменты могут быть однокомпонентными простыми белками и двухкомпонентными, сложными белками с добавочной группой небелковой природы. Сложный фермент в целом называется холофермент, его белковая часть – апофермент, добавочная группа – кофермент. Если добавочная группа прочно связана с апоферментом, ее называют простетической группой. В апоферменте есть специфический коферментсвязывающий домен.
Кофермент можно рассматривать как второй субстрат, так как:
1) кофермент претерпевает химические изменения, в точности противоположные изменениям, которые происходят в субстрате;
2) именно участие кофермента в реакции может иметь фундаментальное физиологическое значение – например, превращение НАДН2 в НАД+ при восстановлении пирувата в лактат, необходимое для синтеза АТФ.
Активный центр фермента – это сочетание субстратного и каталитичес-кого центров. Каталитический центр фермента образуется сочетанием аминокислотных радикалов у простых ферментов или присоединением кофермента у сложных ферментов. В состав активных центров простых ферментов в основном входят такие аминокислоты, как гистидин, тирозин, цистеин, серин, триптофан, аспартат, глутамат, аргинин и лизин. Коферментами чаще всего бывают производные водорастворимых витаминов, металлопорфирины и некоторые другие соединения, в том числе и металлы с переменной валентностью (кофакторы). Металлы кроме коферментной функции могут также быть активаторами ферментов. Если металл при диализе не отделяется от фермента, а более жесткое его удаление приводит к полному подавлению каталитической активности, значит, это истинный металлофермент. Субстратный центр – это участок молекулы, ответственный за присоединение субстрата. Он может совпадать или перекрываться с каталитическим центром, или каталитический центр может окончательно формироваться в момент присоединения субстрата. Во многих случаях прикрепление субстрата к ферменту идет за счет взаимодействия с ε-аминогруппой лизина, карбоксильной группой глутамата или аспартата, или сульфгидрильной группой цистеина. Однако чаще гораздо большее значение имеют гидрофобные взаимодействия и водородные связи.
Аллостерический центр – участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного, а иногда и высокомолекулярного вещества изменяется третичная структура белковой молекулы. Как следствие этого изменяется конфигурация активного центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе аллостерической регуляции ферментов.
Ферменты являются очень активными катализаторами, они повышают скорость катализируемой реакции в 1023 раз и более. Механизм действия ферментов заключается в снижении энергии активации реакции. Кинетическая теория, или теория столкновений, основывается на двух ключевых положениях:
1. Для протекания реакции молекулы должны сталкиваться друг с другом, то есть сближаться на расстояния, достаточные для образования связей.
2. Чтобы столкновение было продуктивным, реагирующие молекулы должны обладать энергией, достаточной для преодоления энергетического барьера.
Химическая реакция S→P протекает потому, что в любой момент времени некоторая доля молекул S обладает большей внутренней энергией по сравнению с другими молекулами данной популяции, и этой энергией оказывается достаточно для достижения ими вершин энергетического барьера и перехода в активную форму, называемую переходным состоянием. Скорость любой химической реакции пропорциональна концентрации молекул, находящихся в переходном состоянии. Отсюда следует, что при наличии у реагирующих молекул достаточной энергии все факторы, повышающие частоту их столкновений, будут повышать скорость реакции. Такими факторами может быть повышение температуры (скорость повышается вдвое на каждые 10оС) и добавление катализаторов, которые находят «обходные пути», позволяющие молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне.
Катализатор Е на промежуточной стадии реакции взаимодействует с субстратом S с образованием комплекса ЕS, переходному состоянию которого соответствует значительно более низкая энергия активации по сравнению с переходным состоянием субстрата S в некатализируемой реакции. Затем комплекс ЕS распадается на продукт Р и свободный катализатор, который опять может соединиться с другой молекулой S и повторить весь цикл.
Ферменты ускоряют химические реакции благодаря тому, что обеспечивают правильную ориентацию молекулы субстрата в непосредствен- ной близости от каталитического центра, предоставляют для катализа протон-донорные и протон-акцепторные группы, образуют при помощи ковалентных связей нестабильные промежуточные соединения с субстратом и вызывают напряжение в молекуле субстрата или ее деформацию. Кроме того, связывание субстрата в активном центре фермента приводит к удале-нию гидратной оболочки субстрата. В результате удаления молекул воды в активном центре фермента во время катализа создаются совершенно другие условия, чем в растворе.
Кинетика ферментативной реакции определяется в первую очередь свойствами катализатора, вследствие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций. Наиболее удобным для практического применения оказалось уравнение Михаэлиса-Ментен
V0=(Vmax[S])/(km+[S])
где Vo – начальная скорость при концентрации субстрата [S],
Vmax – максимальная скорость,
km – константа Михаэлиса для данного фермента к определенному субстрату.
Константа Михаэлиса численно является концентрацией специфического субстрата, при которой данный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине ее максимальной скорости. Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной km и наоборот.
Каталитическую активность фермента определяют в стандартных условиях по увеличению скорости каталитической реакции по сравнению с некаталитической. Обычно скорость реакции указывают как изменение концентрации субстрата или продукта за единицу времени – моль/(л·с). Так как каталитическая активность не зависит от объема раствора, в котором протекает реакция, активность фермента выражают в каталах – это количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. Другой единицей активности является международная единица Е – количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата в 1 мин (1Е=16,7 нкат). Удельной активностью фермента называется число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка; эта мера чистоты ферментного препарата. Числом оборотов фермента называется число молекул субстрата, претерпевающих превращение в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента в условиях, когда концентрация фермента является единственным фактором, лимитирующим скорость реакции.
Свойства ферментов, отличающие их от химических катализаторов:
1. Термолабильность. Несмотря на то, что увеличение температуры усиливает катализ, при высоких значениях температуры происходит денатурация белка и инактивация фермента. Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом. У животных этот оптимум лежит между 40 и 50оС, у растений – между 50 и 60оС. Однако есть отклонения, папаин наиболее активен при 80оС, а каталаза – при 4оС.
2. Зависимость от рН среды. Большинство ферментов имеет максимальную активность при нейтральной рН, так как при других значениях изменяется степень ионизации аминокислотных радикалов. В резко кислой (пепсин – рН 1,5-2,5) или резко щелочной среде (трипсин – рН 7,8, аргиназа – рН 9,5-9,9) хорошо работают лишь некоторые ферменты.
3. Специфичность. Действие большинства ферментов высоко специфично. Для ферментов характерны реакционная специфичность (к типам катализируемых реакций) и субстратная специфичность (к природе соединения). Высокоспецифичные ферменты катализируют расщепление только одного типа связи в субстратах определенной структуры (абсолютная специфичность). Некоторые из этих ферментов отличаются стереохимической специфичностью, то есть действуют только на один из пространственных изомеров. Среднеспецифичные ферменты обладают ограниченной реакционной специфичностью, но широкой субстратной специфичностью (относительная, или групповая, специфичность). Низкоспецифичные ферменты – с низкой реакционной и субстратной специфичностями – встречаются редко. Некоторые из ферментов являются полифункциональными с одной пептидной цепью. Эта цепь при формировании третичной структуры образует несколько доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью. Существует несколько объяснений специфичности действия ферментов. Теория Фишера: фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Гипотеза Кошланда: индуцированное соответствие субстрата и фермента. Гипотеза топохимического соответствия: специфичность действия ферментов объясняется в первую очередь узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе.
4. Подверженность влиянию активаторов и ингибиторов. К числу активаторов относятся ионы металлов и некоторые анионы. Активаторы усиливают каталитическое действие ферментов, в отличие от кофакторов их отсутствие не препятствует протеканию ферментативной реакции. Металлы-активаторы облегчают образование фермент-субстратного комплекса, способствуют присоединению кофермента к апоферменту, обеспечивают становление четвертичной структуры фермента. Ингибиторы бывают двух основных типов:
1) необратимые – связывают или разрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности;
2) обратимые, различают три типа:
а) конкурентные – конкурируют с субстратом за связывание с актив-ным центром, но в отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. По своему строению конкурентные ингибиторы обычно напоминают субстрат данного фермента. Благодаря такому сходству конкурентному ингибитору удается обмануть фермент и связаться с ним. Конкурентное ингибирование можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата;
б) неконкурентные – присоединяются к ферменту не в активном центре, где связывается субстрат, а совсем в другом месте, нарушая конформацию активного центра. Такое ингибирование не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата;
в) бесконкурентные – присоединяются к фермент-субстратному комплексу, препятствуя его распаду.
Ферменты локализованы во всех отделах клетки. Значительная их часть ассоциирована с мембранами. В клетке ферменты обычно собраны в поли-ферментные комплексы. Такие комплексы представляют собой ряд ферментов, катализирующих согласованные реакции, причем конечные продукты одной реакции являются исходными субстратами для следующие реакции. Полиферментные системы могут быть растворены в цитоплазме и субстраты перемещаются от одного фермента к другому посредством простой диффузии (ферменты гликолиза). Ферменты могут быть соединены друг с другом за счет белок-белковых взаимодействий (синтазный комплекс жирных кислот). Также ферменты могут быть в определенном порядке иммобилизированы на мембране (дыхательная цепь).
Регуляция активности ферментов клеткой осуществляется с помощью нескольких механизмов:
1) индукция или репрессия генов, кодирующих синтез соответствующих ферментов;
2) аллостерическое ингибирование – на ключевых участках метаболических путей находятся аллостерические ферменты, белки с четвертичной структурой, имеющие каталитические и регуляторные субъединицы. При накоплении по какой-либо причине продуктов данного метаболического пути эти продукты будут взаимодействовать с регуляторными субъединицами фермента. Это приведет к снижению каталитической активности в результате изменения каталитических центров фермента;
3) ограниченный протеолиз – многие ферменты-протеиназы синтезируются в виде неактивных предшественников (зимогенов). Активируются они вне клеток путем гидролиза некоторых связей полипептидной цепи с после-дующим формированием третичной структуры тогда, когда это нужно;
4) ковалентная модификация – метилирование, гликозилирование, но чаще всего фосфорилирование/дефосфорилирование, фермент нагружается теми низкомолекулярными группами, которые он должен переносить на нужные молекулы, в исходном состоянии он неактивен;
5) агрегация молекул – осуществляется ингибиторами белковой природы, они блокируют действие фермента за счет белок-белковых, взаимодействий в результате чего закрывается активный центр фермента. Например, α1-антитрипсин блокирует действие эластазы, выделяемой нейтрофилами легочной ткани.
Около половины идентифицированных ферментов находится в виде множественных молекулярных форм. Такая гетерогенность обусловлена наличием нескольких генов, каждый из которых кодирует одну субъединицу фермента, а они собираются в разных комплектах. Кроме того, в гене фермента могут иметься множественные аллели. Генетически детерминированные молекулярные формы ферментов называются изоферментами, или изозимами. Распространение изозимов в различных тканях и органах определяется по меньшей мере четырьмя факторами:
1) различия в каких-либо особенностях метаболизма в разных органах. Например, обнаружены различные формы фермента лактатдегидрогеназы в сердечной и скелетной мышцах. Изофермент А4 предпочтительно катализирует быстрое восстановление пирувата в лактат в скелетной мышце при очень низких концентрациях пирувата, тогда как изофермент В4 предпочтительно катализирует быстрое окисление лактата в пируват в мышечной ткани сердца.
2) различия в локализации и метаболической роли фермента в клетках одного и того же типа. Например, фермент малатдегидрогеназа существует в разных формах в митохондриях и цитозоле, где эти изоферменты выполняют несколько различные функции.
3) дифференцировка и развитие тканей взрослого организма из эмбриональ-ных форм этих тканей. Для печени эмбрионов, например, характерно определенное соотношение различных форм лактатдегидрогеназы, изменяющееся в процессе дальнейшего развития этого органа. Некоторые ферменты, катализирующие расщепление глюкозы, были обнаружены в опухолевых клетках в тех формах, которые встречаются у эмбрионов.
4) тонкая регулировка скоростей метаболических реакций, осуществляемая благодаря различной чувствительности изоферментов к аллостерическим регуляторам. Некоторые регуляторные ферменты (например, фосфофруктокиназа) существуют в нескольких молекулярных формах, различающихся по своей чувствительности к модуляторам.
Кроме белков известны также каталитически активные нуклеиновые кислоты – рибозимы. Рибозимами являются малые ядерные РНК (мяРНК), участвующие в посттранскрипционной модификации РНК, а также 28S-рРНК, осуществляющие пептидилтрансферазную реакцию в процессе трансляции белка. Предполагают, что существующие рибозимы можно рассматривать как реликты «мира РНК» – раннего периода биохимической эволюции, когда белки еще не получили такого распространения и не приобрели такого значения, как в последующие периоды.
ЛЕКЦИЯ 10
Дата добавления: 2015-08-08; просмотров: 1801;