Клонування тваринних клітин. Історія клонування

Всі клітини організму тварин несуть однакову генетичну інформацію. Однак у процесі морфогенезу соматичні клітини диференціюються, у результаті чого частина геному репресується. Чим вище рівень спеціалізації клітин, тим менше їх тотипотентність. Ця закономірність була встановлена в експериментах по пересадженню ядер.

Уперше трансплантацію ядер соматичних клітин зародків в енуклейовані клітини жаби здійснили американські дослідники Р. Бріггс і Т. Кінг в 1952 році. Вчені, користуючись мікропіпеткою, видаляли ядра з яйцеклітин шпорцевої жаби, а замість них пересаджували ядра клітин ембріонів, що перебувають на різних стадіях розвитку. Проведені дослідження показали, що ядра ранніх ембріонів у стадії пізньої бластули й навіть ранньої гаструли володіють тотипотентністю й забезпечують нормальний розвиток ембріонів. Якщо брати ядра із клітин зародка на ранній стадії його розвитку – бластулі, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі й перетворюється в нормальний пуголовок. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, перейшов на наступну стадію – гаструлу, то лише менш ніж в 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. При пересадженні ядер з більше диференційованих клітин (мезодерми й середньої кишки) пізньої гаструли в ембріонів спостерігалося недорозвинення й навіть відсутність нервової системи. Після пересадження ядра із клітин більш пізнього розвитку яйцеклітини взагалі не розвивалися.

Більш широкі дослідження, що охоплюють не тільки амфібій, але й риб, а також дрозофіл, в 1962 р. були початі англійським біологом Дж. Гордоном. Він першим у дослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis як донор ядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізовані клітини епітелію кишечнику плаваючого пуголовка. Ядра яйцеклітин реципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина їх утворювала ембріони. 6,5% із цих ембріонів досягали стадії бластули, 2,5% – стадії пуголовка й тільки 1% розвився в статевозрілих особин. Однак поява декількох дорослих особин у таких умовах могло бути пов’язана з тим, що серед клітин епітелію кишечнику пуголовка, що розвивається, досить тривалий час присутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використані для пересадження. У подальших роботах як сам автор, так і багато інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гордон модифікував експеримент. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструли, він спробував витягти з них ядра на стадії бластули й знову пересадити їх у нові енуклейовані яйцеклітини (така процедура називається "серійним пересадженням" на відміну від "первинного пересадження"). Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшувалося, і вони розвивалися до більш пізніх стадій у порівнянні із зародками, отриманими в результаті первинного пересадження ядер.

Потім Гердон разом з Ласкі (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом у поживному середовищі) клітини нирки, легені й шкіри дорослих тварин і використати вже ці клітини як донори ядер. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадженнях вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка. У такий спосіб було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток принаймні до стадії пуголовка.

У свою чергу Ді Берардіно й Хофнер (1983) використали для трансплантації ядра, які не діляться й повністю диференційовані клітин крові – еритроцити жаби Rana pipiens. Після серійного пересадження таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Ці експерименти показали, що деякі ядра соматичних клітин здатні зберігати тотипотентність.

Причини, по яких ядра клітин дорослих тваринних і навіть пізніх ембріонів залишаються тотипотентними, поки точно не встановлені. Вирішальну роль відіграє взаємодія ядра й цитоплазми. Речовини, що містяться в тваринній цитоплазмі, беруть участь у регулюванні експресії клітинних генів ядра. Не виключено, що ядра диференційованих клітин не можуть змінити асинхронну реплікацію ДНК на синхронну, характерну для ранніх стадій ембріогенезу. У зв’язку з цим питання про можливості активації генів у диференційованих соматичних клітинах представляє особливу важливість. Роботи М. ді Бернардіно й Н. Хоффера показали, що цитоплазма ооцитів амфібій містить фактори, які відновлюють тотипотентність ядер диференційованих соматичних клітин. Ці фактори реактивують репресовані ділянки геному.

У 1985 р. була описана технологія клонування кісткових риб, розроблена радянськими вченими Л.А. Слєпцовою, Н.В. Дабагян і К.Г. Газарян. Зародки на стадії бластули відокремлювали від жовтка. Ядра клітин зародків вводили в цитоплазму незапліднених ікринок, які починали дробитися й розвивалися в личинки. Ці експерименти показали, що втрата ядром тотипотентності в процесі онтогенезу пов’язана не із втратою генів, а з їхньою репресією. При культивуванні соматичних клітин in vitro частота тотипотентності ядер збільшується. Генетичний механізм стабільної репресії геному диференційованих клітин не з’ясований, способи відновлення тотипотентності не розроблені, тому в основному ведеться клонування шляхом трансплантації ядер ембріональних клітин.

Пересадження ядер у ссавців почалися пізніше, в 80-х роках. Це було пов’язано з технічними труднощами, тому що зигота ссавців має невеликі розміри. Наприклад, діаметр зиготи миші приблизно 60 мкм, а діаметр заплідненої яйцеклітини жаби близько 1200 мкм, тобто в 20 разів більше. Зигота корови трохи крупніша, ніж зигота миші, діаметр її становить 160 мкм, але пронуклеуси сховані яєчним жовтком, тому перед мікроманіпуляціями необхідна спеціальна обробка зигот.

Незважаючи на перераховані труднощі, перші повідомлення про одержання клонів мишей, ідентичних донорові, з’явилися вже в 1981 році. Як донор були використані ембріональні клітини однієї з ліній мишей, узяті на стадії бластоцисти. Вірогідність отриманих даних спочатку була поставлена під сумнів, тому що відтворити результати проведених експериментів в інших лабораторіях не вдавалося, однак через декілька років Дж. Мак Грат і Д. Солтер також досягли успіху. У цих експериментах клони мишей вдавалося одержати лише в тому випадку, якщо трансплантували ядра ембріонів на стадії не пізніше 2 бластомерів. Було показано, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, що передує стадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. Ці й багато інших даних показують, що в ембріогенезі в мишей клітинні ядра рано втрачають тотипотентність, що пов’язано очевидно, з дуже ранньою активацією геному зародка – уже на стадії 2-х клітин. В інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16-клітинній стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонуванні ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Проте, роботи з мишами, незважаючи на їхню непросту долю, значно розширили наші уявлення про методології клонування ссавців.

Методи трансплантації ядер

У СРСР Б.В. Конюховим й Е.С. Платоновим в 1985 р. був розроблений метод менш травматичного переносу ядер методом мікроманіпуляції. Він протікає у два етапи: спочатку тонкою мікропіпеткою проколюють зони пелюциду й плазматичної мембрани й витягають пронуклеуси, а потім іншою піпеткою, більшого діаметра (12 мкм) у той же отвір уводять диплоїдне ядро донора. У цьому випадку менше травмується цитоплазма зиготи й транспортоване ядро донора.

Трансплантація ядер може здійснюватися й іншим способом, з використанням цитохалазинів (речовин, синтезованих грибами).

Цитохалазин В руйнує структуру мікрофіламентів і сприяє унікальному розташуванню ядра. Ядро залишається з’єднаним із клітиною тоненькою стеблинкою цитоплазми. При центрифугуванні цей місток розривається, утворюються без’ядерні клітини (цитопласти) і каріопласти, що представляють собою ядра, оточені тонким шаром цитоплазми й цитоплазматичною мембраною. Цитопласти відокремлюють від інтактних клітин за градієнтом густини. Вони зберігають здатність прикріплюватися до поверхні культуральної судини й можуть бути використані для злиття з каріопластами інших клітин з метою одержання життєздатної клітини.

Методи виділення каріопластів трохи складніші й містять у собі ряд операцій по центрифугуванню, розділенню в градієнті густини й т.д. У деяких випадках до суміші клітин і каріопластів додають частки танталу діаметром 1 – 3 мкм. Вони проникають у клітини й інколи в каріопласт, тому більш важкі клітини осаджуються швидше каріопластів.

Цитопласти містять всі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають здатність прикріплюватися до субстрату, утворювати складчасту мембрану, пересуватися, здійснювати піноцитоз.

Каріопласти оточені тонким шаром цитоплазми (близько 10% від всієї клітинної цитоплазми), містять компактний ендоплазматичний ретикулум, кілька мітохондрій і рибосом. У деяких клітинних ліній 1/10 каріопластів здатна відновити весь втрачений об’єм цитоплазми й відновитися в життєздатні клітини.

Для реконструкції клітин суспензію каріопластів у сольовому буфері додають до моношару культури цитопластів із пропорції 100 каріопластів на 1 цитопласт. Цитопласти повинні бути вже покриті інактивованими вірусними частинками. Інкубують при температурі 4ºС 45 хвилин, а потім ще 45 хвилин при температурі 37ºС. Відмивають розчином Ерла для видалення каріопластів, які не злилися.