Клонування ссавців. Історія клонування

Американські дослідники С. Стік і Дж. Робл, використовуючи методику Макграта й Солтера, в 1988 р. одержали 6 кроликів, пересадивши ядра 8 клітинних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотип народжених повністю відповідав фенотипу донора. У цих експериментах тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, що практично не дозволяє розраховувати на одержання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи в тому що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.

Перші успішні експерименти по клонуванню сільськогосподарських тварин були проведені С. Уілладсеном (S.Willadsen) в 1986 р. Він зливав без’ядерні яйцеклітини із бластомерами, виділеними з 8 й 16-клітинного ембріона вівці.

Дж. Робл і його співробітники в1987 провели роботи з пересадження ядер великої рогатої худоби. Вони пересаджували в зиготи каріопласти – чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з оточуючою їх цитоплазмою, а також ядра 2, 4 або 8-клітинних ембріонів корови. Спочатку зиготи центрифугували щоб звільнити пронуклеуси від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра були добре видимі під мікроскопом, що значно полегшувало їхнє видалення. За допомогою маніпулятора й загостреної скляної мікропіпетки витягали один із бластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його в енуклейованну зиготу.

Реконструйовані зародки були укладені в агаровий циліндр і пересаджені в перев’язаний яйцепровід вівці. Через п’ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару й досліджували. Реконструйовані зародки в цій роботі розвивалися тільки в тих випадках, коли в зиготи пересаджували пронуклеуси: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластоцисти. Два зародки були пересаджені другому реципієнтові – у матку корови, і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо як донорів використали ядра 2-, 4- або 8-клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули.

Пізніше були й більш успішні роботи. С. Уіладсен (1989) повідомив, що йому вдалося одержати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнської породи в результаті пересадження в реципієнтні яйцеклітини ядер бластомерів одного 32-клітинного зародка. Автор стверджував, що більшість ядер зберігає тотипотентність на 32-клітинній стадії, а значна їхня частина навіть на 64-клітинній стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепроводі вівці. Після пересадження в матку корів – остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.

К. Бондіолі й співавтори (1990), використовуючи в якості донорів ядра 16 – 64-клітинних зародків корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і отримали 92 живих телят. Сім з них були генетично ідентичні, являючи собою клон, отриманий у результаті пересадження ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотипотентність і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені.

Експериментів по клонуванню свиней небагато. Успішні дослідження провели Р. Пратер зі співробітниками в 1989 р. Недостатня кількість даних, мабуть, пов’язана з певними труднощами роботи із цим об’єктом.

У 1993 – 1995 роках, група дослідників під керівництвом Я. Уілмута (Ian Wilmut) з Рослінського інституту одержала клон овець – 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин. Клітинну культуру одержували в такий спосіб: виділяли мікрохірургічно ембріональний диск із 9-денного овечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2 – 3-х пасажів, клітини ставали ущільненими й морфологічно подібними до епітеліальних. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро й реципієнтна цитоплазма перебували на подібних стадіях клітинного циклу, зупиняли ділення культивованих клітин TNT4 на певній стадії (G0) і ядра цих клітин пересаджували в енуклейовані яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони помістили в агар і трансплантували в перев’язані яйцепроводи овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцепроводу першого реципієнта й досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягли стадії морули або бластоцисти й пересаджували їх у матку вівці – остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося 5 ягнят (самок) з них 2 загинули невдовзі після народження, 3-й у віці 10 днів, а 2, ті що залишились нормально розвивалися й досягли 8 – 9-місячного віку. Фенотипово всі ягнята були подібні до породи овець, від якої одержували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, – значне досягнення в клонуванні ссавців, хоча вона й не викликала настільки гучного інтересу, як стаття того ж Уілмута зі співавторами, опублікована на початку 1997 року, де повідомлялося, що в результаті використання донорського ядра клітини молочної залози вівці була отримана клональна тварина – вівця по кличці Доллі. Остання робота методично багато в чому повторює попереднє дослідження 1996 року, але в ній учені використали ембріональні й фібробластоподібні клітини плода й клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози одержували від шестирічної вівці породи фін дорcет, що перебуває на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітинних культур мали однакове число хромосом – 54, як звичайно в овець. Ембріональні клітини використали як донори ядер на 7 – 9-му пасажах культивування, фібробластоподібні клітини плода – на 4 – 6-му пасажах і клітини молочної залози – на 3 – 6-му пасажах. Ділення клітин всіх трьох типів зупиняли на стадії G0 й ядра клітин пересаджували в енуклейованні ооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Був використаний метод електрозлиття. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев’язаному яйцепроводі вівці, але деякі й in vitro у певному хімічному середовищі. Коефіцієнт виходу морул або бластоцист при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вище, ніж при культивуванні в яйцепроводі.

Вихід морул або бластоцист у серії дослідів з культурою клітин молочної залози був приблизно втроє меншим, ніж у двох інших серіях, коли як донори ядер використали культуру фібробластів плода або ембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні із числом пересаджених у матку остаточного реципієнта морул або бластоцист було також у два рази нижче. У серії дослідів із клітинами молочної залози з 277 реконструйованих яйцеклітин було отримано лише одне живе ягня, що говорить про дуже низьку результативність такого роду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи народжених у трьох серіях експериментів живих дитинчат показав, що клітини молочної залози були донорами ядер для одного, фібробласти плода – для двох й ембріональні клітини – чотирьох ягнят. Вівця по кличці Доллі розвилася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивована клітина молочної залози вівці породи фін дорсет і фенотипово не відрізняється від овець цієї породи, але сильно відрізняється від вівці-реципієнта. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Успіх авторів цієї роботи насамперед пов’язаний з використанням тривалих клітинних культур, тому що після багатьох пасажів у культурі клітин могли бути відібрані малодиференційовані стовурові клітини, які, ймовірно, і були використані як донори ядер. Велике значення також мав той факт, що автори, з огляду на результати своїх попередніх робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів і клітин донорів.

Аналогічні експерименти проводили пізніше Tanja Dominko і співробітники лабораторії Вісконсинського університету, які забезпечили клонування ембріонів із клітин шкіри вух дорослої рогатої худоби. Ембріони, генетично ідентичні корові, від якої відбирали клітини вуха, були впроваджені в матки корів – реципієнтів. Спостерігалася поступова загибель ембріонів, тому життєздатних телят не одержали. Причини поки не встановлені.

У серпні 1997 року з’явилося повідомлення про те, що Алан Троунсон (Австралія) розробив технологію, яка дозволяє сформувати ембріон з 16, 32 або 64 клітин і потім кожна з них може використатися для формування 16, 32 або 64 ідентичних ембріонів. Колектив дослідників на чолі з Аланом Троунсоном створив 470 генетично ідентичних ембріонів рогатої худоби від єдиної бластоцисти. Така технологія забезпечує безмежне джерело генетичного матеріалу для клонування.

Незважаючи на відсутність негайних практичних результатів зробленого відкриття, теоретичну значимість його важко переоцінити. Уперше було доведено, що гени запрограмовані зворотно. Подальші дослідження можуть дозволити зрозуміти, як регулюється робота генів, диференціація клітин, чому клітини в одних випадках ростуть і розмножуються керовано, а в інші (при раку) – неконтрольовано.

Уже зараз корпорація Genzyme Transgenics планує дослідження з метою створення трансгенної великої рогатої худоби, що містить у молоці людський альбумін. Був куплений патент на одержання ембріонів, що містять геном клітин сполучної тканини (фібробластів), що включає ген, відповідальний за синтез людського білка. Декілька корів у наш час вагітні трансгенними телятами. Подібна технологія дозволяє збільшити ефективність створення трансгенних молочних тварин, тому що при звичайному введенні генів у запліднену яйцеклітину народжується тільки 5 – 10% трансформованих тварин, з них – декілька самців. Використання нової технології клонування дозволяє одержувати тварин тільки жіночої статі, що дають трансгенний протеїн.