Использование методов рекомбинации ДНК в биотехнологии

1. Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование, или генная инженерия) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном количестве, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать. Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ. Эксперименты по клонированию включают следующие этапы:

1. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК).

2. Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном.

3. Обработка рестриктационными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине.

4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор-встроенная ДНК».

5. Введение этой конструкции в клетку-хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Это процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток.

6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

7. Получение специфичного белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами.

2. Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции. Рестриктазы являются составной частью системы рестрикции – модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз.

Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса 1 разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы 1 и 3 классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Ферменты 2 класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.

В н.в. используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав, рН среды, концентрация кислорода, т.д.). С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. coli.

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Многие рестрицицрующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. В результате образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4 нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами».

Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями , которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов, ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.

Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора:

1) плазмиды;

2) бактериофаги.

Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 1-3 % генома бактериальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие – несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке – они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существую в одной клетке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполняла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репликация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки.

Т.о., плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств:

· небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в E.coli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

· наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

· наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 ^оС в течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации – 10^-3, т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100 %, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки.

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используются E.coli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность E.coli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E.coli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов – полилинкер.

Эффективными методами трансформации E.coli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Использование бактериофагов в качестве носителей генетической информации основано на том, что рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке-хозяина. С этой целью применяют бактериофаг l-вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смыкается в кольцо. Бактериофаг М-13 – вирус нитевидной формы с кольцевой замкнутой ДНК, которая в клетке превращается в двухцепочечную и реплицируется в клетках-потомках. В поисках эукариотических систем экспрессии, для получения биологически активных белков, созданы бакмиды – экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов для E.coli и клеток-насекомых. Выход рекомбинантных бакуловирусов в такой системе повысился до 99 %. Клетки насекомого, инфицированные бакуловирусами, синтезировали гетерологичный белок. Векторы на основе фага удобны для создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций с фрагментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК переклонируют в плазмиды.

Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют космиды – плазмиды, несущие cos-участок (компелементарные липкие концы) ДНК фага l. Наличие cos-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции, а не трансформации. Фазмиды – гибриды между фагами и плазмидами – способны развиваться как фаг и как плазмида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмидные векторы.

Т.о., для получения любого белкового продукта необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей м-РНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нужном сайте необходим промотор, для ее остановки - терминирующий кодон.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, интенсивно используют обычные дрожжи S.cerevisiae; генетика этих одноклеточных организмов хорошо изучена. Рекомбинатные белки, синтезированные в системах экспрессии S.cerevisiae, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов.

Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уникальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.