Криосохранение клеток

1 Остановимся на основных этапах криосохранения клеток. Экспериментально показана возможность хранения при сверхнизких температурах культивируемых клеток, изолированных меристем, кончи­ков побегов, зародышей, пыльцы. Однако для криосохранения столь раз­личающихся между собой объектов, конечно, требуются различные подходы и условия начиная с самого начального этапа работы. Лучше всего методы криосохранения разработаны для суспензионных культур. Мелкие меристемоидные клетки более устойчивы к замораживанию, чем крупные вакуолизированные клетки. То же касается мелкодис­персных суспензий с рыхлыми агрегатами клеток по сравнению с больши­ми плотными массами клеток. Клетки тропических видов растений могут оказаться менее устойчивыми, чем клетки растений умеренной зоны. Для более сложно организованных структур, таких, как меристемы, зароды­ши, эмбриоиды, требуется оптимизация условий каждого этапа. Особое значение имеет специальная подготовка культуры, целью ко­торой является обогащение ее клетками меристематического типа. Длительное культивирование в осмотике, синхронизация деления клеток, сокращение сроков пересадки способствуют уменьшению размеров клет­ки и увеличивают их выживаемость. На отдельные культуры положитель­ное влияние на жизнеспособность клеток оказывает предварительное куль­тивирование с некоторыми аминокислотами, благодаря увеличению уровня эндогенных сахаров в клетках. Для суспензионных культур важным мо­ментом подготовки является концентрирование.

2 Криопротекторы - это вещества, которые снижают точку за­мерзания, связывают внутриклеточную воду и защищают клетки от механического и осмотического стресса. К ним относятся диме­тилсульфоксид (ДМСО), глицерин, пролин и сахароза, которая является для растений естественным криопротектором. Сами криопротекторы тоже могут вызвать осмотический стресс, поэтому подбираются их оптималь­ные концентрации и сочетания.

ДМСО обладает уникальной проникающей способностью, это особен­но важно для крупных плотных организованных структур, например ме­ристем. Для них этап подготовки заключается, главным образом, в пред­варительном культивировании с добавлением в среду 5% ДМСО. Это обес­печивает создание эффективных криозащитных концентраций по всему апексу, размер которого около 0,3-0,5 мм.

Наряду с выбором криопротекторов, причем именно для данных кле­ток, очень важно найти оптимальную программу замораживания. Разли­чают медленное постепенное замораживание, быстрое и сверхбыс­трое. При медленном постепенном замораживании температура в интер­вале от 0 ^о до - 40^о снижается со скоростью 0,5-1 ^о в мин. При быстром замораживании объект в ампуле с криопротектором погружается сразу в жидкий азот.При сверхбыстром замораживании сам объект непосред­ственно вводится в жидкий азот. Пыльцу можно замораживать в сухом виде, запечатанную в специальные пластмассовые ампулы, погружая их в жидкий азот. Данные, полученные криобанком ИФР в Москве: показывают, что бо­лее успешные результаты дает программированное замораживание. Для этого требуются специальные конструкции с рабочей камерой, охлаждае­мой с запрограммированной скоростью введением паров жидкого азота.

3 Оттаивание и восстановление роста культур - ответственные и часто критические этапы процесса. При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит повторное образование льда, оказывающее поврежда­ющее действие. Быстрое оттаивание предотвращает это. Оттаивание про­изводят погружая ампулы в теплую баню (+40 ^оС) либо капая на замороженные объекты теплую воду или среду для культивирования. Однако в исключительных случаях болеецелесообразным оказывается медленное оттаивание.

После оттаивания удаляется криопротектор, что обычно делается на холоде.Основная часть физических изменений в клетках происходит при замораживании и оттаивании, однако только что оттаявшие клетки силь­но предрасположены к дальнейшим повреждениям и поэтому требуют тща­тельного «выхаживания». Это начинается с прямого пересаживания кле­ток на восстанавливающую среду без промывки с сохранением в клетках криопротекторов. Часто криопротектор удаляется специальными ус­ловиями отмывки.

4Состояние культур оце­нить очень сложно, когда материал находится на криосохранении. Оценка проводится после оттаивания и нужна для ис­пользования культур. Для быстрой оценки культур наиболее пригодны тес­ты на жизнеспособность. Тесты желательно проводить не сразу после оттаивания, а на следующий день. Тесты проводят периодически в процессе возобновления роста для контроля за увеличением содержания жиз­неспособных клеток или живой ткани.

Для образцов, видимых под микроскопом в проходящем свете, т. е, клеточных суспензий, протопластов, небольших каллусных и организован­ных структур, используют окрашивание флуоресцеиндиацетатом, феносафранином. Для каллусов и плотных крупных организо­ванных структур используют соли тетразолия.

Количественной оценкой выживания является рост. Изучают рост культивируемых клеток используя любые стандартные методы измерения роста, включая прирост сырой и сухой массы, объем осевших клеток, оп­тическую плотность клеток, прямое микроскопическое наблюдение. Стан­дартные цитологические методы позволяют оценить степень поврежде­ний и восстановительных процесса в, происходящих в тканях. Еще более точные данные получают при исследовании ультраструктуры в электрон­ном микроскопе.

Учитывая гетерогенность культур клеток, их подготовку к заморажива­нию, нельзя полностью исключить возможность проявления селективных преимуществ для какой-нибудь субпопуляции, в особенности при низкой выживаемости после оттаивания. Поэтому бывает нужна генетическая, физиологическая и биохимическая проверка.

На этапе рекультивирования иногда применяют известные приемы ин­тенсификации роста клеток во избежание селекции возможных мутантных холодоустойчивых клеток. Установлено, что хранение в жидком азоте не влияет на выживание и возобновление клеточных культур. Рекультивированные после хранения в жидком азоте клеточные культуры идентичны исходным и пригодны для биотехнологического применения.

Таким образом, криобанк клеток, меристем, пыльцы обеспечивает сохранение генофонда не только культивируемых in vitro штаммов-продуцентов, но и редких и исчезающих видов, что особенно важно для вегетативно размножаемых растений.