Соматическая гибридизация

1. Существует ряд методик по введению чужеродных хлоропластов в изолированные протопласты. Одна из методик предусматривает последовательное центрифугирование протопластов и пластид в 0,03 % растворе лизоцима, который обладает модифицирующим действием на мембрану. Частота проникновения чужеродных органелл в протопласты в данном случае составляет 0,5 %. Другой метод заключается в том, что изолированные одиночные клетки инкубируют с ферментом целлюлазой. После проявления первых протопластов клетки переносят в суспензию хлоропластов в 2 % растворе целлюлазы и 0,2 М NaNO₃ при рН -5,4. С помощью этого метода проведено успешное включение в протопласты функционально активных хлоропластов с дальнейшей регенерацией целых растений. Осуществлена пересадка пластид черного паслена, несущих гены, контролирующие устойчивость к атразину, культурному картофелю. Анализ хлоропластной ДНК, устойчивых к атразину растений-регенерантов картофеля показал, что хлоропласты этих линий произошли от паслена.

Перенос высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растений. Среди большого разнообразия генетически измененных форм растений, образовавшихся из слившихся протопластов, встречаются формы, содержащие пластиды одного родителя, а митохондрии другого, и наоборот.

2. Новым направлением клеточной инженерии растений является создание необычных биологических систем путем введения микроорганизмов в популяцию культивируемых клеток. Создание таких ассоциаций представляет интерес для решения следующих задач:

1) экспериментальной проверки теории эндосимбиотического происхождения эукариотической клетки в процессе эволюции;

2) моделирования природных симбиотических отношений растений микроорганизмов;

3) повышения продуктивности культивируемых растительных клеток;

4) получения растений с новыми свойствами;

5) изучения различных аспектов взаимодействия растения-хозяина и патогена.

Получение искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа на основе культивируемых клеток или изолированных протопластов с микроорганизмами является одним из новых способов модификации растительной клетки. Довольно перспективным является получение ассоциаций культур клеток растений с микроорганизмами, способными к фиксации молекулярного азота атмосферы. Способность к формированию азотфиксирующих симбиотических систем приобрели определенные группы высших растений и микроорганизмов. В связи с этим вопрос о повышении способности к вступлению в такие симбиотические ассоциации для большинства растений имеет важное экономическое значение и может быть решен методами клеточной инженерии.

Следовательно, становится возможным конструирование клеток с новыми свойствами. Реконструированные клетки, происходящие из ядра и цитоплазмы разного происхождения, являются удобными экспериментальными моделями для решения таких важных биологических проблем, как дифференцировка, старение клеток, цитоплазматическая наследственность. Гибриды растений с генетически реконструированной цитоплазмой представляют собой весьма ценный материал для оценки влияния двух цитоплазматических генофоров на различные практически значимые признаки возделываемых культур.

3. Генетическая инженерия как способ переноса новых генов становится эффективным инструментом селекции культурных растений. Чтобы настроить в хромосому нужный структурный ген, требуется вектор-нуклеотидная последовательность, способная включаться в ДНК, не нарушая ее целостности. Вектор должен отвечать следующим требованиям:

а) должен автономно реплицироваться;

б) иметь маркеры, по которым легко можно обнаружить трансформированные клетки;

в) введение чужеродной ДНК не должно нарушать функций генома.

В поисках вектора ученые, в первую очередь, обратили внимание на плазмиды фитопатогенных бактерий, в частности, плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Эта почвенная бактерия вызывает образование опухолей (корончатых галлов) в области корневой шейки растения. Бактерия вводит в растительную клетку агент, индуцирующий опухоль. Этим агентом является участок Т-плазмиды, так называемая Т-ДНК, которая несет гены, ответственные за синтез опинов. В здоровых растениях опины не обнаруживаются, они начинают синтезироваться в инфицированном растении. Бактерия способна расти только в присутствии одного из опинов, используя его в качестве источника углерода и азота. Гены, ответственные за перенос Т-ДНК в растительную клетку и ее встраивание в хромосомную ДНК, находятся вне Т-ДНК. Т-ДНК обладает двумя свойствами, делающими ее идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений.

В качестве векторов привлекают внимание исследователей также ДНК хлоропластов и митохондрий. Плазмиды рекомбинированные с миникольцевыми молекулами ДНК хлоропластов и митохондрий, могут служить векторами, которые способны реплицироваться в клетках. Хлоропласты содержат до нескольких десятков кольцевых молекул ДНК одинакового размера, гомогенных по структуре. Хлоропластные ДНК способны к автономной репликации и транскрипции. При обработке их рестриктазами получают фрагменты ДНК, строго специфичные для каждого вида растений.

Митохондриальный геном растений устроен иначе. Если в хлоропластах ДНК представлена одинаковыми кольцевыми молекулами, то в митохондриях содержится несколько классов кольцевых молекул. Наличие миникольцевых ДНК характерно для митохондрий многих высших растений. Кроме того, митохондриальный геном растений отличается большой информационной емкостью. Не исключено, что роль универсального вектора смогут выполнять также мобильные генетические элементы, так называемые транспозоны.

Разработаны различные методы введения чужеродных генов в протопласты. Можно заражать протопласты, инкубируя их непосредственно с Ti-плазмидами, несущими нужный ген, в присутствии ПЭГ и Са²⁺. Т-ДНК проникают в протопласты и трансформируют их. После регенерации протопластами клеточной стенки и деления образованный каллус переносят на среду, не содержащую фитогормоны. В этих условиях выживают и размножаются клетки,

содержащие Т-ДНК, поскольку в этом сегменте есть гены, ответственные за синтез фитогормонов.

Можно заражать агробактериями культуру клеток. Через несколько часов бактерии убивают добавлением в среду антибиотиков и продолжают культивировать клетки до образования каллусов. Затем каллусы переносят на среду без гормонов, на которой выживают только трансформированные клетки. Эффективность метода культивирования протопластов с агробактериями составляет 10 %.

Кроме описанных выше естественных механизмов трансформации с использованием агробактерий, разработан ряд искусственных методов введения молекул ДНК в протопласты. Ее заключают в липосомы-пузырьки из фосфолипидов, которые к тому же могут надежно защищать ДНК от нуклеаз. Часть ДНК проникает в ядро и реплицируется там, что было установлено по поведению ДНК, меченой тритием. Эффективность метода 1 %.

Значительно более результативен метод микроинъекции ДНК (40 %). Этим методом можно вводить не только в протопласты, но и в клетки. Некоторые исследователи осуществляют прямую трансформацию под влиянием различных воздействий, например, электрического импульса либо ультрафиолетового лазера. В стенке клетки пробивается микроскопическое отверстие, которое через секунду заживляется, но за это время внутри клетки успевает проникнуть ДНК с эффективностью около 1 %.

Таким образом, возможность введения в клетки растений чужеродной генетической информации экспериментально доказана и открывает многообещающие перспективы для создания принципиально новых форм растений с хозяйственно ценными признаками.