Биотехнология вакцин

В медицине и ветеринарии широко применяются разнообразные вакцины против инфекционных болезней человека и животных. К сожалению, ряд вакцин слабоиммуногенны, либо имеют побочные эффекты, либо требуют больших производственных расходов.

Рекомбинантные бактериальные вакцины. Иммуногенные свойства патогенных микроорганизмов чаще определяются конкретным белком или полисахаридной молекулой возбудителя, который кодируется одним-единственным геном. В настоящее время достижения генной инженерии дают исследователям возможность заставить прокариотную или эукариотную клетку синтезировать определенный антиген патогена, который будет служить основой для создания генно-инженерной вакцины.

Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в структуру ослабленных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток высших организмов встраивается ген, который отвечает за образование антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. При этом отпадает необходимость в использовании убитых или ослабленных бактерий и вирусов, обеспечивается безопасность работников предприятий по производству вакцин, отсутствует токсичный или инфекционный материал, который часто загрязняет микробный антиген, полученный из клеточных культур, улучшается экологическая обстановка. Основным объектом приложения для генно-инженерных работ стали противовирусные вакцины, что объясняется простотой организации вирусных геномов. Более сложное строение бактериальных клеток и сравнительно низкая стоимость противобактериозных вакцин являются факторами, сдерживающими развитие генно-инженерных работ. В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены не только гены, контролирующие синтез антигенов возбудителя, но и гены, кодирующие различные медиаторы (белки) иммунного ответа (интерфероны, интерлейкины и др.).

Первым среди возбудителей бактериальных инфекций человека внимание исследователей, занимающихся созданием генно-инженерных вакцин, привлек Treponema pallidum - возбудитель сифилиса. И это неслучайно. Во-первых, несмотря на то, что в распоряжении современной медицины имеются эффективные методы диагностики и терапии, сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и развивающихся странах; во-вторых, получение чистых культур бледной трепонемы представляет большие трудности, так как она не растет в искусственной среде; в-третьих, невозможно получить вакцину против него с помощью общепринятых методов, основанных на экстракции и очистке антигенов. Ловетт с коллегами (Университет шт. Калифорния) в 1982 году, используя бактериофаг в качестве вектора, ДНК этой спирохеты клонировали в клетках кишечной палочки. Генетический материал для эксперимента был выделен из яичек специально зараженных кроликов. Они получили штамм E.coli, который содержал не менее семи специфических антигенов трепонемы. Эти исследования имели своей целью разработку более специфичных тестов для диагностики сифилиса и производства эффективной вакцины (цит. по А.Сассон, 1987).

В ветеринарии первой генно-инженерной противобактерийной вакциной, нашедшей применение на практике, является вакцина против колибактериозов (эшерихиозов) поросят и телят, вызываемых патогенными штаммами E.coli. Разработчик этой вакцины - голландская ветеринарная фармацевтическая компания “Intervet international”. С целью выделения белка в количествах, достаточных для получения вакцины, они клонировали ген, ответственный за синтез адгезивных антигенов кишечной палочки К88 и К99, в штамме E. coli К-12. Эти антигены в комбинации с адъювантом были использованы для получения вакцины. Иммунизация коров и свиней этой вакциной вызывала образование защитных антител, которые затем передавались новорожденным с молозивом и молоком. Аналогичные вакцины были разработаны и компанией “Цетус” совместно с “Норден лэборатриз” (США) и “Тек Америка груп”.

Для конструирования живых генноинженерных (рекомбинантных) вакцин необходимы три составляющие их компонентов: бактериальный вектор - носитель гетерологических протективных антигенов, гены синтеза гетерологического антигена и генетические структуры, обеспечивающие стабильную и контролируемую экспрессию протективных антигенов, способных в свою очередь индуцировать эффективную защиту иммунизированного организма.

В качестве бактериальных векторов находят применение сальмонеллы, эшерихии, микобактерии, бациллы, листерии, йерсинии, коринебактерии лактобактерии и франциселлы. При создании рекомбинантных вакцин для ветеринарной медицины наиболее приемлемыми на сегодня являются вакцинные штаммы S.typhimurium, S.choleraesuis, S.dublin, S. еnteritidis, S. аbortusovis, Mycobacterium bovis (шт.BCG), Bac.subtilis, Francisella tularensis (Э.А.Светоч и соавт., 2000). Большинство исследователей в качестве бактериального вектора используют генетически охарактеризованные штаммы сальмонелл, выдвигая в пользу этого следующие аргументы: сальмонеллы могут применяться как перорально, так и парентерально, стимулируя местный и системный иммунитет, включая выработку сывороточных антител и секреторных антител слизистых, клеточно- опосредованный иммунитет и антителозависимую цитотоксичность.

В ГНПЦПМ (Россия) активно разрабатываются проблемы по изучению возможности использования в качестве бактериальных векторов вакцинных штаммов Bac.anthracis. Это обусловлено в первую очередь следующими причинами: показана принципиальная возможность секреции чужеродных белков клетками вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, неприхотливость бациллы к питательным средам и, наконец, высокая устойчивость спор Bac.anthracis, что обеспечит повышенную сохраняемость и стабильность конечных форм вакцинных препаратов.

К антигенам, обеспечивающим полноценную защиту, могут быть отнесены, например, антигены адгезии и термолабильный энтеротоксин патогенных эшерихий, О- и Vi-антигены сальмонелл, холерный и дифтерийный токсины, токсины возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены, злокачественного отека, капсульные антигены чумного микроба и др. Особенно актуальной для ветеринарии является разработка комбинированной вакцины против сибирской язвы и бруцеллеза (Шумилов К.В.). Получена генетическая конструкция, в которой функционируют ген летального токсина сибиреязвенного микроба и ген поверхностного белка Brucella abortus с мол. массой 31 кД (А.П Померанцев). В РосНИПЧИ «Микроб» были сконструированы генно-инженерные штаммы с клонированным геном pag, кодирующим синтез протективного антигена – основного иммуногена возбудителя сибирской язвы.

Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют и «субъединичными». Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

В ветеринарной науке определенные успехи достигнуты в разработке субъединичной вакцины против ящура. Для защиты от этой инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.

Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl-ген.

Геном вируса ящура представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E.coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой p^L-промотор—cl-peпpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок вируса ящура, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих вирус антител. Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний.

В последнее время интенсивно изучаются белки теплового шока Mycobacterium tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины. С помощью ИФА и моноклональных антител к HSP65 определено наличие белков теплового шока Mycobacterium tuberculosis в сыворотках крови у больных с подтвержденным туберкулезом и в сыворотках крови у пациентов с подозрением на туберкулез (И.А.Баснакьян и соавт, 2010). HSP65 Mycobacterium tuberculosis обнаруживали в цереброспинальной жидкости у больных туберкулезным менингитом, и наличие этого антигена может считаться диагностическим маркером туберкулезного менингита. Проведены исследования наличия сывороточных антител к HSP70 , HSP65 и HSP 16 Mycobacterium tuberculosis при туберкулезе и саркоидозе. При этом обнаружен значительно более высокий уровень указанных антител в сыворотках крови у пациентов с туберкулезом и саркоидозом, чем в сыворотках крови у здоровых людей. Таким образом, доказана важная роль белков теплового шока в стимуляции иммунитета. О.А.Шараповой и соавт.(2009) были отработаны методы получения рекомбинантного белка теплового шока HSP70M Mycobacterium tuberculosis, изучены его параметры и проведен анализ HSP70M на соответствие требованиям доклинических испытаний. Шевчик Ю.С. и соавт.(2009) установлено, что рекомбинантный HSP70M Mycobacterium tuberculosis усиливает активацию врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении с бактериальными антигенами в эксперименте.

В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis. Из жидкой бактериальной культуры были выделены и очищены шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовались для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis, что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека.

Синтетические пептидные вакцины. Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Идея использования синтетических пептидов в качестве вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механизмов развития иммунитета. В 1974 г. М.Села впервые описал искусственно полученный пептид, вызывающий образование антител к белку лизоцима. Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные естественным антигенам, например, сальмонеллезным полисахаридам.

Техника рекомбинантных ДНК для получения вакцин открыла новые перспективы в разработке синтетических вакцин. Производство последних может заменить имеющиеся бактериальные и вирусные вакцины, часто содержащие посторонние антигенные детерминанты, белки и другие вещества, вызывающие побочные эффекты. Одиберт с сотр. (1981) использовали синтетический антиген дифтерийного токсина для активной иммунизации. Данный токсин представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 62 кД и имеет две дисульфидные связи. Токсичность и иммуногенность белка обусловлены петлей на N-конце молекулы, состоящей из 14 аминокислот, удерживающихся дисульфидным мостиком. Синтетический пептид, связанный с двумя различными носителями, иницировал синтез антител, которые связывались с токсином и предотвращали его дермонекротическое и летальное действие. Формирования иммунитета удалось также добиться при инъекции синтетического пептида белка М Streptococcus pyogenes длиной всего 20 аминокислот. Такие иммуногенные олигопептиды могут составить основу безопасных вакцин против стрептококковых инфекций, которые вызывают ревматизм и связанные с ним поражения сердца.

Дрисман с коллегами (1982) синтезировали два пептида, аналогичные таковым на участке между 117-м и 137-м аминокислотными остатками полипептидной цепи поверхностного антигена вируса гепатита В (цит. по А.Сассон, 1987). Два пептида с последовательностями от 117-й до 137-й и от 122-й до 137-й аминокислоты вводили мышам внутрибрюшинно, используя различные адъюванты. В каждой группе у половины мышей через 7-14 дней после иммунизации были обнаружены антитела против поверхностного антигена вируса. Через три недели у большинства животных титры антител уменьшались.

В Исследовательском институте клиники Скриппса и Институте вирусологии животных (США) синтезированы полипептиды, соответствующие нескольким участкам белка VP1 вируса ящура. В дальнейших исследованиях они обнаружили, что один из полипептидов, включающий участок от 141-й до 160-й аминокислоты VP1, при инъекции с адъювантом и в комплексе с гемоцианином улитки (KLH) иницирует у морских свинок и кроликов синтез антител к вирусу. Причем, титры антител были в несколько раз выше, чем в случае иммунизации животных очищенным белком VP1. Эти животные проявляли устойчивость к последующему заражению (Bittle et al., 1982). Кроме того, преимущество синтетического пептида заключалось и в том, что однократное введение вызывало достаточный иммунный ответ. Данный пептид вызывал образование антител в количестве, достаточном для создания иммунитета у свиней и крупного рогатого скота против ящура. Создание вакцин против ящура на основе синтетических полипептидов могло бы устранить проблемы, возникающие в связи с недостаточной инактивацией вируса и нестабильностью инактивированных вакцин при рН ниже 7 и неблагоприятном температурном режиме внешней среды. Этот подход позволил бы использовать в качестве иммуногенов синтетические пептиды, соответствующие различным серотипам вируса.

Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 вирса ящура. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных вакцин, содержащих домен 142-160 VP1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных вирусов, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего b-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP1 вируса ящура, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия.

И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин: эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда; конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице; изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

В процессе разработки находятся и другие антигены, нацеленные на создание иммунитета против вирусных инфекций. Например, антиидиотипические антитела, получаемые в ответ на иммунизацию противовирусными антителами (Lerner et al., 1985; Dreesman et al., 1985). Антитела, синтезированные против антител, способных узнавать определенные антигенные эпитопы, в свою очередь, сохраняют особенности структуры данных детерминант. Как известно, антиген и антитело соответствуют друг другу как ключ замку. Другими словами, активный центр антитела является как бы слепком детерминанты иммунизирующего антигена. В результате последовательных иммунизаций исходным антигеном, а затем и антителами первого и второго поколений можно получить антитела третьего поколения, по существу повторяющие исходные антитела первого поколения, полученные при иммунизации непосредственно вирусным антигеном. Возможность использования моноклональных антител для получения антиидиотипических антител с “образом” определенных антигенов открывает новые перспективы в конструировании вакцин нового типа. Это особенно важно в борьбе с вирусными инфекциями, возбудителей которых трудно получить в достаточном количестве для разработки вакцин, а также при работе с антигенными эпитопами конформационной природы, для которых невозможно или сложно создавать химические или генно-инженерные вакцины.

Антиидиотипические вакцины обладают рядом преимуществ перед традиционными профилактическими препаратами. В первую очередь иммуноглобулиновая природа АИАТ исключает возможность реверсии живого аттенуированного микроорганизма в вирулентную форму. Имитация CDR-областью (Complementarity determining region- область, определяющая комплементарность) АИАТ конкретного протективного эпитопа антигена обеспечивает направленную индукцию защитных антител макроорганизма, устраняя синтез антител против слабоиммуногенных и неиммуногенных детерминант микроба или компонентов химических вакцин, что значительно влияет на эффективность иммунизации. Кроме того, как известно, синтетические пептиды, соответствующие участкам первичной аминокислотной последовательности, созданные путем химического синтеза или молекулярного клонирования, не всегда способны поддерживать нативную трехмерную структуру, необходимую для индукции антител нужной специфичности и иммуногенности, что было подтверждено и на модели возбудителя чумы, в отличие от АИАТ, отбираемых именно по конформационной специфичности как «зеркальное отражающих» форму антигенного эпитопа.

Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин против чумы изучались Федоровым В.А. и Девдариани (2006). Ими получены мышиные АИАТ к белкам Y.pestis c мол. Массой 72, 54, 25 и 87 кД, кодируемым плазмидой вирулентности возбудителя чумы. Для этого мышей линии BALB/с иммунизировали по оригинальной схеме МКА к каждому из антигенов. Комплементарность исходным антигенам была подтверждена с использованием иммунохимического, функционального, иммунологического и иммунобиологического критериев оценки природы «внутреннего образа» соответствующих антител. Все АИАТ реагировали с ксеногенными (кролики, лошади, морские свинки и мыши) сыворотками к исходным антигенам, индуцировали высокий уровень специфических антител с серологическими свойствами, идентичными идиотипическим МКА, демонстрировали выраженную адъювантную активность и были классифицированы как принадлежащие к субтипу АТ2-бета. Наиболее важным свойством АИАТ была способность защищать от экспериментальной чумы не менее 77-80% мышей. Авторы полагают, что АИАТ являются перспективными компонентами при конструировании профилактических препаратов против чумы. Одним из существенных преимуществ антиидиотипических вакцин перед, например, аттенуированными или рекомбинантными живыми вакцинами является возможность их экстренного однонаправленного применения с антибактериальными препаратами при чрезвычайных ситуациях природного, техногенного или биотеррористического характера.

ДНК-вакцины.Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 10³-10⁴ раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.

Плазмидная ДНК представляет собой кольцевую ковалентно-замкнутую молекулу длиной 4-6 тысяч пар нуклеотидов. В ней имеется участок, ответственный за начало транскрипции (промотор), ген протективного белка, ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику (ампициллину), и участок репликации плазмидной ДНК. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена протективного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Плазмидную ДНК реплицируют в клетках кишечной палочки в присутствии ампициллина, очищают и вводят внутримышечно животным в дозе 10 –12 млрд. молекул. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01-1,0%), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой 2 с образованием информационной РНК, которая в цитоплазме обеспечивает синтез протективного белка. Плазмидная ДНК длительное время (до 3-6 мес.) функционирует в клетках. В организме животного плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы, и на нее не образуются антитела. Синтезированный в клетках протективный белок расщепляется в цитоплазматических протеосомах на короткие пептиды (8-10 аминокислот). Последние связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса 1 и транспортируются к клеточной поверхности. Синтезированный протективный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство в свободном нерасщепленном состоянии. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза и расщепляется в эндосомах на короткие фрагменты (10-20 аминокислот). Фрагменты белка объединяются с молекулами ГКГС класса 2 и встраиваются в поверхностную мембрану клетки. На поверхности клетки комплексы антиген +молекулы ГКГС 2 распознаются Т-хелперами. В-лимфоциты под воздействием протективного белка и антигенспецифических активированных Т-хелперов превращаются в антителопродуцирующие клетки.

Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед. после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.

Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В у животных (но не у человека), а также возбудителям микоплазмоза, туберкулеза и сальмонеллеза. В опытах на лабораторных животных показана возможность применения ДНК-вакцинации для защиты от СПИДа и др. Появляются и работы по использованию ДНК-вакцин и в ветеринарии. P.J.Lewis (1997) показали возможность использования векторных плазмид для иммунизации против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, а W.Jiang (1998) – эффективность ДНК-вакцинации при парвовирусной инфекции собак. Протективный иммунитет наблюдали у животных, вакцинированных плазмидой, кодирующей гликопротеин С вируса болезни Ауески (V.Gerdts et al., 1997). Получены результаты по ДНК-вакцинации против вирусной диареи телят ( S.Harpin et al., 1997). Плазмида, кодирующая Hbs-антиген вируса гепатита уток В защищала их от инфекции при заражении (M.Triyatni et al., 1998).

Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспартат-b-полу-альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd-генерастут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют.

Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения.

В настоящее время актуальным направлением в разработке генноинженерных вакцин является конструирование различных ДНК-вакцин на базе одного плазмидного вектора. При этом меняют только ген, кодирующий протективный белок. Следует отметить, что ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. В одну плазмидную ДНК можно встраивать гены протективных белков нескольких возбудителей и гены цитокинов – регуляторов иммунного ответа. Проходят экспериментальное изучение ДНК-вакцины, изготовленные из вирусов иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, гепатита В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей туберкулеза и паразитарных заболеваний (малярий и лейшманиоза). Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных. Однако остаются не решенными проблемы безопасности для человека вакцин из плазмидной ДНК. Не определена степень риска мутагенных эффектов и иммунопатологических реакций в ответ на введение ДНК-вакцины. Отсутствуют четкие представления о побочных действиях образовавшихся антигенов и медиаторов иммунного ответа.

«Векторные» вакцины.В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187т.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилирование мРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина.

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации in vivo следующим образом.

Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антиген (например, HBcAg), встраивают в плазмидный вектор непосредственно после клонированного ВКО-промотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимидинкиназы. Далее, этой плазмидой трансформируют культуру дефектных по тимидинкиназе животных клеток, обычно фибробластов куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует функциональную тимидинкиназу. В результате рекомбинации между нуклеотидными последовательностями, фланкирующими промотор и ген протективного антигена, и гомологичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание клонированного гена в вирусную ДНК. Частота таких рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, используя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствие тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию. И, наконец, проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном антигенного белка.

Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 10³—10⁴ вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген пео, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазу II и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицина G-418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО.

Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус будет содержать и экспрессировать ген-мишень. ДНК ВКО дикого типа несет ген vp37, отвечающий за образование бляшек при росте вируса в монослойной культуре животных клеток. Если заменить этот ген маркерным геном Е. coli, то образуется мутантный ВКО, который не формирует бляшки при выращивании его в течение 2—3 сут в культуре животных клеток. Ген-мишень вводят в этот мутантный вирус с помощью гомологичной рекомбинации его ДНК с вектором, несущим ген vp37 и ген-мишень. Мутантный ВКО, получивший ген vp37, приобретает способность к образованию бляшек, при этом в его геном встраивается ген-мишень, а маркерный ген утрачивается. Мутантный вирус с делегированным геном vp37 не может реверсировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная частица, образующая бляшку, содержит желаемую конструкцию. Этот метод прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких-либо дополнительных маркерных генов и не прерывает рамку считывания генов ВКО.

В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: G-белка вируса бешенства, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP- и НА-белков вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора. Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО-промоторы: pll (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол. массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов.

Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-лимфоцитами (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса.

Нежелательные побочные эффекты пролиферации ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений.

Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2a мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серин, который в elF-2a фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. K3L-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2альфа, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены К3L-последовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L^- . Этот штамм оказался в 10—15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа. Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью делеций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону.

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса, как системы доставки и экспрессии соответствующего гена, необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10^-6. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность.

Бактерии как системы доставки антигенов. Антигены, находящиеся на наружной поверхности бактериальной клетки, обладают более высокой иммуногенностью, чем локализованные в цитоплазме. Поэтому один из подходов, используемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител.

Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella. При этом было известно, что эпитоп, включающий 50—64 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-10⁶ живых или убитых формалином бактерий с модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (50—64 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину.

С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E. coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella. В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella, в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB, можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования.

Съедобные вакцины.Успехив области генетической инженерии открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой целишироко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако они имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходит посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотных белков. Клетки млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, однако использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего необходимо отметить, что в высших растениях происходит гликозилирование и фолдинг белков, сходные таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, в отличие от животных, растительные клетки не содержат в составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, служат безопасным источником рекомбинантных белков. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходит значительно проще по сравнению с животными.

Революционным направлением в современной вакцинологии является разработка вакцин на основе трансгенных растений, в геном которых был встроен соответствующий фрагмент генома патогенного микроорганизма. Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов получили название «съедобных вакцин». Механизм иммунизации вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. Секреторные иммуноглобулины IgM транспортируются на поверхность слизистой оболочки, где они связываются с чужеродными агентами и препятствуют проникновению их в организм. Следует отметить, что мукозная вакцина стимулирует как иммунный ответ слизистых оболочек - первого защитного барьера на пути патогенных объектов, так и общий иммунный ответ организма. Первая такая вакцина была получена в 1992 год: трансгенное растение табака стало продуцировать «австралийский» антиген. Полученный из растений и частично очищенный антиген, введенный мышам, вызывал мощный иммунный ответ подобно вакцине против гепатита В. В 1998 году с помощью картофеля, продуцирующего В-субъединицу холерного анатоксина, была получена выраженная защита у поедавших его мышей при заражении их холерой. В том же году 10 из 11 добровольцев, получивших по 100 г сырого картофеля, продуцирующего антигены энтеропатогенной кишечной палочки, начали вырабатывать в слизистой кишечника антитела к этому возбудителю. Сейчас испытываются «картофельные» вакцины к возбудителю диареи и гепатита В с обнадеживающими результатами. На животных испытываются вакцины против бешенства, ящура. Исследования проводятся на основе трансгенных растений картофеля, салата, кукурузы, шпината, люцерны и др. Получен иммуногенный мембранный белок Brucella abortus Omp 16 врастительных клетках табака (А.А.Чистякова, 2010). С учетом необходимости использования эти «вакцинные продукты» в сыром виде, ведутся исследования по выращиванию вакцин на растениях, которые не требуют приготовления, например, на бананах, на моркови. А.А.Какимжановой и соавт.(2011) получены полноценные трансгенные растения моркови, несущие гены антигенов возбудителя туберкулеза M.tuberculosis esat6 и cfr 10. Проведен полный цикл выращивания трансгенных растений от индукции соматических зародышей из трансформированных клеток, устойчивых к антибиотику канамицину в условиях in vitro, до получения полноценных растений, способных к формированию корнеплодов. На сегодняшний день получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда антигенов (стафилококки, стрептококки, вирус простого герпеса, раковый эмбриональный антиген). Трансгенные растения рассматриваются и как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов человека и животных.

Контрольные вопросы: 1. Принципы создания генноинженерных вакцин; 2. Какие микроорганизмы находят применение в качестве бактериальных векторов при создании рекомбинантных вакцин? 3. Какие вакцины называют субъединичными, синтетическими, векторными и ДНК-?

Лекция №5