Микроманипуляция с эмбрионами животных

Получение однояйцевых близнецов.Основной предпосылкой проявления естественного многоплодия у млекопитающих является одновременное оплодотворение не менее двух вышедших из фолликулов зрелых яйцеклеток разными сперматозоидами. Крупный рогатый скот характеризуется малой частотой двойневости – в среднем 0,025. Среди двойневых телят иногда встречаются однояйцевые двойни. Вероятность появления таких генетически идентичных близнецов составляет всего 0,01%.

Низкие показатели частоты двойневости и ее наследуемости не позволяют рассчитывать на высокую эффективность селекции. Поэтому большую практическую значимость приобретает совмещение методов копирования генотипов высокопродуктивных животных на основе разделения ранних эмбрионов методами микрохирургии и микроманипуляции на два или более бластомеров, способных развиваться в процессе всего онтогенеза, т.е. способных проявить свою тотипотентность.

Возможность микроманипулирования с отдельными эмбрионами была доказана еще в 1936 году G Pincus. Он вводил одиночные бластомеры из 2-клеточного эмбриона кролика в яйцевод ложнобеременной крольчихи. Эмбрионы нормально развивались с дифференциацией их клеток до стадии бластоцисты (стадии 2-х, 4-х и 8-ми бластомеров; стадия морулы; стадия бластоцисты). Затем было получено потомство у кроликов и мышей из 2-клеточных эмбрионов (стадия 2-х бластомеров) с разрушением одного бластомера путем прокола его иглой. Эти исследования служили основой для дальнейшего совершенствования техники микроманипулирования с эмбрионами животных, и в частности для получения однояйцевых близнецов. Последнее имеет большое значение для интенсификации животноводства, так как способствует увеличению выхода молодняка от одного донора и позволяет получать генетически идентичные двойни.

О получении однояйцевых двоен у овец путем разделения 2-клеточного бластомера впервые сообщил S.M.Willadsen в 1979 году. Он разделил бластомеры на две отдельные клетки, а нарушенную зону пеллюцида (образование, предотвращающее рассыпание бластомеров, а также контакт их с другими эмбрионами, чужеродными клетками, лейкоцитами, сперматозоидами и облегчающее прохождение эмбриона через яйцепровод) закупоривал агаром. Заключение разделенных бластомеров в агар, который практически нерастворим в половом тракте самки, позволяло им выживать и развиваться in vivo. Для культивирования заключенных в агар эмбрионов в качестве временных реципиентов использовались овцы (лигатированный яйцевод овцы является наиболее подходящим объектом и для развития эмбрионов коровы, лошади и свиньи вплоть до бластоцисты). Выживаемость ”половинок” эмбрионов на этой стадии развития после трансплантации реципиентам составила около 50%. У овец 2-клеточные бластомеры можно получить только в течение очень короткого периода времени. Так, спустя 60 часов большинство эмбрионов находятся на 4-клеточной стадии развития. Из-за значительных колебаний интервалов между инъекцией сыворотки жеребых кобыл (СЖК) и началом охоты, началом охоты и началом овуляции почти невозможно во время операции найти у овцы эмбрионы, находящиеся на 2-клеточной стадии. Поздние опыты показали, что генетически идентичные двойни могут быть также получены из 4- и 8- клеточных бластомеров путем разделения их на две группы. Такие “половинки” оказались одинаково жизнеспособными, как нормальные эмбрионы овец. Установлено, что эмбрионы, полученные из отдельных бластомеров 8-клеточных не обладают жизнеспособностью. Предполагают, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим их способность развиваться в жизнеспособные бластоцисты.

Для получения однояйцевых близнецов была с успехом применена техника заключения в агар разделенных на части бластомеры эмбрионов крупного рогатого скота. Так, В 1981 году S.M.Willadsen со своими коллегами получили телят - однояйцевых близнецов. Исследования были проведены на 5-6-дневных эмбрионах на стадии морулы, поскольку у коров более целесообразно получать зародыши нехирургическим путем. Морулы были разделены на “половинки” или “четвертинки”, заключены в агар и перенесены в лигатированный яйцевод анэстральной овцы на 1-2 суток. Затем их извлекали и трансплантировали хирургическим способом реципиентам на 6-й и 7-й день полового цикла. При этом приживляемость “половинок” была достаточно высокой (75%), тогда как этот показатель у “четвертинок” был значительно ниже (41%). Причем, у последних приживляемость была ниже и той, которая была отмечена ранее после пересадки “четвертинок”, полученных из пары 8-клеточных бластомеров. Авторы приходят к выводу о том, что способность разделенных эмбрионов коровы регулировать свое развитие при уменьшении числа клеток в значительной степени сохраняется даже на стадии морулы. W.R. Allen и R.L. Pashen (1984) в экспериментах на лошадях доказали возможность получения однояйцевых близнецов по аналогичному методу с использованием 2-8-клеточных бластомеров.

G.Brem et al. (1983) разработали технологию получения однояйцевых близнецов с использованием 6-суточных эмбрионов (морул), полученных нехирургическим способом. Эмбрионы фиксировали пипетками. С помощью микроножа разрезали зону пеллюцида, а затем стеклянными иглами открывали разрез. Через отверстие вводили микронож или стеклянную нить для разрезания морулы на две половины. Одну половинку эмбриона оставляли в собственной зоне пеллюцида, а другую помещали в прозрачную зону неоплодотворенного ооцита крупного рогатого скота. По данным авторов, приживляемость разделенных эмбрионов составила 60%. Из всех имплантированных эмбрионов получено 50% пар близнецов; каждый третий разделенный эмбрион давал пару близнецов.

Последующие эксперименты по получению монозиготных двоен были нацелены на использование поздних морул и бластоцист, поскольку на этих стадиях развития для эмбрионов большинства животных защита со стороны зоны пеллюцида несущественна. S.M.Willadsen и R.A.Godke (1984) осуществляли разделение эмбрионов овцы на стадиях поздней морулы, ранней, поздней и вылуплившейся бластоцисты на две равные половинки с разрезом зоны пеллюцида. При этом часть половинок эмбрионов оставалась внутри разорванной зоны пеллюцида, а другие были трансплантированы без нее. Половинки эмбрионов пересаживали тем же овцам, у которых их извлекали. 16 из 18 овец окотились: 7 гол. принесли одинцов, 8 гол. - однояйцевых двоен и 1 голова - неоднояйцевую двойню. Причем, не выявлено значение зоны пеллюцида в развитии разделенных бластоцист. Приживляемость половинок эмбрионов на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты была почти вдвое ниже (42%), чем на стадии поздней и вылупившейся бластоцисты (79%). Исследователями не получено ни одной однояйцевой двойни после трансплантации эмбрионов, разделенных на стадии морулы, тогда как после пересадки бластоцист, разделенных на всех трех стадиях развития, получены однояйцевые близнецы. Имеются сообщения и о возможности использования эмбрионов коров и свиней на более поздних стадиях развития для получения однояйцевых близнецов (Willadsen, 1981; Zambeth et al., 1983; Baker et al., 1984; Rorie et al., 1985).

Эффективным тестом для оценки выживаемости половинок эмбрионов является культивирование их в течение 2-4 часов в период между разделением и пересадкой. Культивирование половинок эмбрионов в течение ночи или более чем 12 ч сопровождалось заметным снижением их выживаемости.

Получение химерных животных. Понятие химера означает составное животное. В современном понятии термин химера используется главным образом при получении составных организмов, у которых генетически разные клеточные популяции происходят более чем от одной зиготы или более чем от одного зародыша. Получение химер или генетических мозаиков в настоящее время является одним из перспективных направлений биотехнологии. Сущность такого биотехнологического метода, основанного на достижениях клеточной инженерии и микроманипуляции на ранних эмбрионах, заключается в искусственном объединении эмбрионов клеток двух и более животных, относящихся не только к одной породе, но и к разным породам и даже видам. Животные-химеры несут признаки разных генотипов. Это достигается путем объединения бластомеров от двух или более эмбрионов или введения клеток одного эмбриона в полость бластоцисты другого эмбриона. Все до сих пор известные в науке экспериментальные химеры млекопитающих созданы методами агрегации двух (или более) генотипически разнородных зародышей или путем микроинъекции клеток внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. Первый метод получил название агрегационный, второй – инъекционный.

Fehilly et al. (1984) получили сложные химерные эмбрионы овец путем объединения 2-, 4- и 8-клеточных бластомеров. Каждый из таких зародышей состоял из равного количества бластомеров эмбрионов от 2-8 родителей. Результаты обследования 48 ягнят в 2- мес. возрасте показали, что 36 гол. являются химерными по анализам крови, по внешним признакам или по тем и другим показателям. Спустя год Butter et al. получили химерных ягнят путем инъекции внутренней клеточной массы, выделенной из зародышей доноров, в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Из полученных 15 ягнят 5 гол. были определены химерами по группам крови и 1 голова по внешним признакам. Brem et al. (1985) получили химеры у крупного рогатого скота путем соединения половинок 5-6-дневных эмбрионов. 2 теленка из 7 имели признаки химеризма. Один теленок по масти был химерой бурой швицкой и голштино-фризской, хотя группу крови он унаследовал у родителей голштино-фризской породы. Другой теленок был неопределенной химерой. Church et al. (1985) получили химерных телят путем слияния морул без зоны пеллюцида. Они установили, что передача химере каждого родительского типа носит случайный характер, т.е потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов.

Наиболее показательно получение химер от слияния клеток зародышей разных видов животных. Известно, что ни овца, ни коза не вынашивают гибридное потомство до родов. Как правило, плоды от экспериментальной гибридной беременности у овец и коз к концу 2-го месяца погибают. Непосредственной причиной абортов при межвидовых беременностях считается усиление иммунологических реакций материнского организма на антигены плода, что ведет к нарушению функции плаценты. Fehilly et al. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4-5 сут. в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты, которые являются жизнеспособными и могут развиваться до рождения нормального потомства. В результате слияния по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, трансплантация которых завершилась рождением 7 ягнят. Все они были похожи в основном на ягнят, но у 3 из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью. Объединив 8-клеточные эмбрионы овцы и козы, исследователи получили 5 потомков, похожих на ягнят, но 2 из них были с аналогичными отклонениями по шерстному покрову, 2 потомка были похожи на козлят с некоторыми отклонениями в шерстном покрове у одного из них. Животные с внешними признаками химеры имели группы крови овцы, за исключением одного потомка, у которого определены группы крови родителей обоих видов.

Приведенные результаты экспериментов свидетельствуют о возможности осуществления трансплантации химерных эмбрионов между близкими видами животных. Межвидовые трансплантации могут оказать неоценимую помощь в сохранении исчезающих видов от вымирания, поскольку обычная трансплантация эмбрионов может дать малую пользу, так как самки-реципиенты не всегда могут быть в достаточном количестве. Техника получения химер может найти применение и в выведении животных с желательными хозяйственными признаками, а также резистентных к определенным болезням.

Химерные животные не передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным животным у потомков происходит расщепление, в результате чего нарушаются ценные генетические комбинации. Хотя химерные животные поддерживают хозяйственно важные признаки лишь на протяжении одного поколения, в разведении крупного рогатого скота они могут представлять большой практический интерес. Например, можно создать химерных животных, сочетающих такие признаки, как молочная и мясная продуктивность, которые являются антагонистами и несовместимы в одном организме. Создание инъекционных химер путем введения в эмбрион определенных линий клеток позволит улучшить иммунную систему и повысить устойчивость к ряду болезней.

Получение клонированных животных. Клонирование животных - это получение идентичных потомков путем пересадки ядер эмбриональных клеток в половые клетки с удаленными ядрами. Получение от высокопродуктивной коровы-донора пяти 32-клеточного бластомера и пересадка каждого ядра в энуклеированную яйцеклетку позволяет получать от донора одновременно 160 эмбрионов. При повторении этой процедуры с полученными “вторичными” эмбрионами открываются возможности получения неограниченного количества потомков.

Впервые осуществили пересадку ядер на амфибиях Бриггс и Кинг в 1952 году. Они показали, что ядра из ранних эмбриональных клеток сохраняют способность к дальнейшему развитию после пересадки их в энуклеированные яйцеклетки. Ядра специализированных, т.е. прошедших глубокую дифференциацию, соматических клеток взрослых лягушек утрачивали тотипотентность (свойство клеток полностью реализовать свой потенциал развития с образованием целого организма), и в лучшем случае развитие генетических копий происходило до ранних стадий головастиков. Ими же установлено, что ядра из зародышей на более поздней стадии развития, а также из менее развитых эмбрионов при пересадке в яйцеклетку не дробятся. Newport и Korscher (1982) объясняют это дифференциацией эмбриональных клеток, которая проявляется на стадии перестройки мидбластулы, т.е. на стадии, при которой зародыш начинает продуцировать собственную РНК.

Первое сообщение об успешной пересадке ядер млекопитающих на примере мышей появилось в 1981 году (Illmense and Hoppe). В данном эксперименте ядра извлекались из клеток внутренней массы бластоцисты и микропипеткой пересаживались в зиготу другой линии мышей. Этой же пипеткой удаляли из зиготы ее пронуклеусы. После культивирования зиготы in vitro до стадии бластоцисты эмбрионы трансплантировали реципиентам – мышам третьей линии. Полученные 3 потомка как по генотипу, так и по фенотипу были идентичны с линией мыши-донора. В 1986 году Willadsen осуществил пересадку ядер на овцах. Он извлекал неоплодотворенные яйцеклетки через 30-33 часа после обработки их хорионическим гормоном в начале охоты. Зона пеллюцида над полярным тельцем яйцеклетки разрезалась тонкой стеклянной иглой. Через час после выдерживания яйцеклетки в фосфатной среде с цитохалазином полярное тельце с окружающей его цитоплазмой отсасывалось. Таким образом удавалось разделить примерно 90% яйцеклеток на две части с интактными клеточными мембранами, каждая из которых содержала примерно половину цитоплазмы. Цитологический анализ показал, что примерно 75% тех половинок, которые были удалены с полярным тельцем, содержали хромосомы, т.е. были “ядерными” половинками яйцеклетки, тогда как другие половинки из тех же ооцитов не содержали ядерных структур, т.е. оказались энуклеированными. Одиночные бластомеры из 8- или 16-клеточных эмбрионов вводились под зону пеллюцида энуклеированной яйцеклетки. Слияние ядра с цитоплазмой клетки осуществлялось с помощью вируса Сендай или электрического тока. Клетки заключались в агар и пересаживались в лигатированные яйцеводы овцы. Через 4-5 дней оценивали развитие эмбрионов. Стадии бластоцисты достигали от 33% до 48% эмбрионов. В данном опыте пересадка 3 из 4 бластоцист сопровождалась рождением потомства. Эти ягнята были получены из эмбрионов, в которых бластомер из 8-клеточного зародыша был пересажен в энуклеированную половинку неоплодотворенной яйцеклетки. В другом эксперименте была достигнута суягность от пересадки эмбрионов из 16-клеточных бластомеров.

Prather et al. (1987) пересаживали бластомеры из двух 32-клеточных зародышей коров в энуклеированные ооциты после созревания in vivo и in vitro путем электрослияния. Ооциты, извлеченные через 36 часов после начала охоты и использованные в качестве реципиентов ядер эмбриональных клеток, чаще достигали стадии морулы или бластоцисты, чем яйцеклетки, созревшие in vitro или извлеченные через 48 часов после начала охоты. Достигнуто 7 стельностей после трансплантации 19 эмбрионов 13 телкам. У 2 телок родились живые телята. Приведенные данные дают основание полагать, что с совершенствованием эффективности техники пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные ооциты можно получать множественные копии из единичного эмбриона.

Получение гомозиготных диплоидных потомков. При чистопородном разведении традиционно используют линейное разведение, целью которого является поддержание высокого генетического сходства с выдающимся родоначальником. Это достигается путем умеренного инбридинга и целенаправленного отбора. Животные таких линий, имея высокую степень гомозиготности, отличаются большим генетическим сходством. При этом внутри линии создается высокая фенотипическая однородность в отношении физиологических и морфологических признаков. К сожалению, создание инбредных животных требует много времени, так как это связано с расщеплением и рекомбинацией генов, низкой плодовитостью и большим интервалом между генерациями.

Метод получения гомозиготных диплоидных потомков во многом сходен с технологией пересадки ядер из соматических клеток в энуклеированную зиготу. Однако в последнем случае получаются гетерозиготные животные, а не гомозиготные по всем генам одного из родителей. Сущность метода заключается в следующем. Из зиготы, находящейся на стадии двух пронуклеусов, микрохирургически удаляют мужской или женский пронуклеус, в результате чего в ней остается только один гаплоидный набор хромосом – мужской или женский. Для развития зиготы, содержащей гаплоидный набор хромосом, требуется ее активация или восстановление диплоидного набора. С этой целью проводят кратковременную инкубацию гаплоидной зиготы в растворе с цитохалазином В. Последний препятствует первому клеточному делению, но активизирует деление ядра и диплоидизацию оставшегося пронуклеуса. Как только произошло деление ядра, зародыш отмывают от него, чтобы не происходило увеличение числа наборов хромосом.

Проведенные опыты с пересадками пронуклеусов между зиготами мыши показали, что у млекопитающих для нормального развития эмбриона вплоть до рождения необходимы как мужские, так и женские пронуклеусы. Предполагают, что диплоидный геном, полученный только от одного из родителей одного пола, не может обеспечить нормальное развитие эмбриона. Считают, что отцовский геном требуется для формирования внезародышевых тканей, а материнский – для прохождения определенных стадий эмбриогенеза. Новые данные нуждаются в теоретическом осмыслении и экспериментальном подтверждении. Предстоят глубокие и многолетние исследования для преодоления методических трудностей в получении гомозиготных диплоидных животных.

Определение и регулирование пола.Получениеживотных определенного пола является не только биологической, но и практической проблемой. Это особенно важно для молочного скота, у которого главный хозяйственно полезный признак – молочная продуктивность – относится к признакам, ограниченным полом. Поэтому возникает крайне важная задача регулирования соотношения полов, необходимого для эффективного разведения животных. Генетический механизм определения пола обеспечивает расщепление потомков по полу в соотношении 1:1. Известно, что парный набор гомологичных половых хромосом ХХ в кариотипе млекопитающих определяет развитие самки, а гетерогенных ХY-хромосом – самца. В течение многих лет ведутся работы по разделению сперматозоидов, несущих Х- и Y - половые хромосомы. С этой целью были испытаны разные методы: центрифугирование, седиментация, электрофорез, фильтрация, цитофлуорометрия, иммунологические и др. Наиболее перспективным из них является метод, основанный на применении лазера. Установлено, что спермии с Х- хромосомами содержат больше ДНК, чем спермии с Y- хромосомами, а положительные или отрицательные заряды клеток зависят от количества ДНК. При использовании лазера спермии вначале проходили флюоресцентную обработку, после чего их пропускали через лазерный луч и под воздействием отрицательно и положительно заряженных пластин они отклонялись в соответствующую сторону. В настоящее время данный метод внедряется в производство фирмой «Sexing Technologies Navasota Texas». По данным производителя однополой спермы при использовании флуоресцентного красителя и мощного фотоумножителя с помощью проточной скоростной лазерной цитометрии возможно выделить фракции содержащие до 92% клеток с Х- или Y-хромосомой. С 2008 года однополая сперма поставляется и в Казахстан.

Контрольные вопросы: 1. Расскажите о методах получения однояйцевых близнецов, предложенных разными исследователями; 2. В чем практическая значимость химерных животных (генетических мозаиков)? 3. Чем отличается метод получения гомозиготных диплоидных потомков от технологии клонирования животных?; 4. Какой из методов регулирования пола животных внедряется в животноводство Казахстана?

Лекция №7