Совершенствование ИФА для диагностики болезней животных

В настоящее время в совершенствовании серологической диагностики заразных болезней широко используются методы, основанные на использовании ИФА. Это и понятно: ИФА является высокочувствительным тестом, позволяющим за короткое время исследовать большое количество образцов сыворотки крови. Однако высокая чувствительность теста, в первую очередь, требует применения в нем антигена, специфичного для возбудителя. Иначе, высокая чувствительность ИФА идет во вред его диагностической ценности, показывая ложноположительные результаты вследствие наличия у возбудителя и некоторых микроорганизмов общих антигенных детерминант.

Бруцеллез животных остается одной из главных проблем ветеринарии Казахстана. В ИФА-наборах, используемых в последнее время для серологической диагностики инфекции, в качестве антигена выступают липополисахариды (ЛПС) молекулы бруцелл. Известно, что ЛПС Brucella практически единтичны аналогичному антигену, полученному из Yersinia enterocolitica 0:9, и имеют гомологичные эпитопы с многими грамотрицательными микроорганизмами на которые в организме животных имеются антитела. Кроме того, иммунной системе вакцинированного организма более доступны ЛПС, расположенные поверхностно, и поэтому антитела в основном вырабатываются на детерминанты полисахаридной молекулы. В этой связи, нет сомнений в том, что использование данного антигена в ИФА приводит к необоснованному убою определенного поголовья здоровых животных, выработавших антитела в результате иммунизирующей субинфекции или вакцинации.

В НИИ биотехнологии КазАТУ им. С.Сейфуллина (А.К.Булашев и соавт.) проведена работа по определению диагностической ценности белков внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19. Выбор данного антигена основан на следующих положениях. Во-первых, грамотрицательные микроорганизмы, хотя и имеют большие сходства между собой по ЛПС, существенно различаются по антигенам БВМ. Во-вторых, в иммунизированном организме вакцинные штаммы задерживаются, как правило, в течение короткого времени (1-3 мес.). Поэтому для иммунной системы вакцинированных животных более доступны ЛПС, расположенные на поверхности клетки, чем белковые антигены «замаскированные» сложным комплексом поверхностной структуры. В этой связи привитый организм успевает вырабатывать антитела в основном на ЛПС. В организме инфицированного животного происходит длительная персистенция бруцелл, сопровождающаяся реакцией иммунной системы на возбудителя болезни, пытающегося локализоваться в излюбленных им органах. Это приводит к накоплению в тканях большого количества продуктов распада бруцелл, среди которых имеются и БВМ, которые ранее были не доступными для иммунной системы.

Тест-система ИФА для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, разработанная сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина, основана на использовании БВМ бруцелл. Как показали результаты исследований, тест оказался более специфичным, нежели общеизвестные серологические реакций. Постановка ИФА проводилась в двух вариантах. В непрямом ИФА БВМ были иммобилизированы к твердой фазе неспецифически, а в «сэндвич» варианте – посредством моноклональных антител (МКА), имеющих специфичность к эпитопу белка с молекулярной массой 50 кД. Сравнивая диагностическую значимость двух методов постановки ИФА, исследователи предпочтение отдают «сэндвич» варианту. Во-первых, в последнем случае белковый антиген, в составе которого имеется эпитоп моноклональных антител, фиксируется к твердой фазе специфически. При этом другие белковые компоненты БВМ бруцелл удаляются в процессе отмывки лунки планшеты. Таким образом, в ходе постановки «сэндвич» ИФА первые антитела осуществляют отбор антигенов, свойственных для бруцелл из состава БВМ бруцелл. Это, безусловно, повышает специфичность данного теста. Разработчик имеет научно-техническую документацию и опытные образцы иммуноферментного диагностикума (зарегистрирован в Государственном реестре ветеринарных препаратов за №РК-ВП-2-0126-04 от 27.01.2004.). Авторские права защищены патентом РК №14230 «Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза» (Бюл.№4, опубл.15.04.2008.). Высокая специфичность белковых антигенов Leptospira, серогруппы Hebdomadis была отмечена нами при серологической ИФА-диагностике крупного рогатого скота на лептоспироз в сравнении с другими иммунологическими методами. (А.К.Булашев, 2005). Диагностикум существенно превосходил по чувствительности и специфичности реакцию микроагглютинации и лизиса (РМАЛ) и на 6% больше выявлял серопозитивных животных, чем его зарубежный аналог «IФА-лептоспiроз-ВРХ» (М.А.Куйбагаров, 2006).В литературе имеются сообщения о перспективности использования БВМ в диагностике других инфекционных болезней. Например, на основе БВМ Yersinia pseudotuberculosis сконструирован псевдотуберкулезный видоспецифический антигенный полимерный диагностикум для объемной реакции агглютинации. При этом чувствительность диагностикума составлял 100%, специфичность – 85,7-89,5% (Д.И.Симакова и др., 2011).

Большую практическую значимость имеют и методы детекции антигенов возбудителей инфекционных болезней, предложенные учеными КазАТУ им.С.Сейфуллина. Так, диагностический набор, основой которого являются МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА, позволяет обнаруживать Brucella abortus в патматериале, а именно в паренхиматозных органах и лимфатических узлах, а также в содержимом желудка аборт-плодов (А.К.Булашев, 1992). МКА упомянутых штаммов были использованы Н.А.Бызовой и соавт. (2011) для разработки экспрессных иммунохроматографических тестов (ИХТ) для детекции антигенов Brucella abortus и антител против данного патогена. Тесты для определения антигена Brucella abortus позволяют в течение 10-15 мин выявлять в биоматериале ЛПС в концентрациях до 5 нг/мл., единый стандартный бруцеллезный антиген до 1 млн.кл/мл. Результаты серологический исследований с помощью ИХТ полностью совпали с данными ИФА.

Экспресс-тест на основе МКА был апробирован нами и для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале. Установлено, что «dot» ИФА с использованием антител к Mycobacterium bovis как в «сэндвич», так и в прямом варианте по чувствительности и специфичности, и, естественно, по времени проведения (3,5-4 часа) существенно превосходит классические методы исследований (микроскопический, бактериологический) и сопоставим с ПЦР-диагностикой. Данный тест, в отличие от других использованных, давал возможность дифференцировать Mycobacterium bovis от других видов, включая представителей атипичных микобактерий (А.К.Булашев и соавт., 2010; 2011). Заслуживает внимания и иммуноферментный диагностикум, предназначенный для серологического обследования крупного рогатого скота на туберкулез (A.K.Bulashev, 2003). По результатам апробации у всех животных, показавших позитивные результаты одновременно по ИФА и аллергической пробе, в легких и лимфатических узлах выявлены поражения, характерные для туберкулеза, тогда как у коров, реагировавших только на ППД-туберкулин, видимые изменения во внутренних органах не обнаруживались.

В связи с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, ящуру и бешенства ветеринарная служба Казахстана нуждается в эффективных экспресс-тестах для мониторинга санитарного состояния объектов внешней среды. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина и Национального центра биотехнологии РК (НЦБ РК) разработан высокоспецифичный метод индикации возбудителя B.anthracis в почве, основанный на использовании двух видов МКА в «dot» ИФА на нитроцеллюлозной бумаге (А.К.Булашев и соавт., 2005). Чувствительность теста составляла 4 500 м.кл./мл. Кроме того, его можно использовать для обнаружения сибиреязвенных бацилл и в других объектах внешней среды (вода, корма), а также в сырье животного происхождения.

Учеными двух названных научных учреждений были созданы 3 штамма-продуцента МКА к вирусу ящура и 4 гибридомы, синтезирующие антитела к вирусу бешенства и предложены методы ИФА для лабораторной диагностики упомянутых вирусных болезней (А.К.Булашев и соавт., 2005). Тест-система для идентификации антигенов вируса бешенства методом ИФА разработана и НИИ проблем биологической безопасности РК (Е.С.Жилин и соавт.,2011) . В результате проведенных исследований в 13 из 15 исследованных полевых материалах (мозг и слюна), отобранных от коров, овец, лис и корсаков, имеющих клинические признаки заболевания бешенством, выявлен антиген вируса бешенства. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб полевых материалов с использованием коммерческого ИФА-набора для диагностики бешенства (Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Казань). НЦБ РК и НИИ Физико-химической медицины (г.Москва) получен штамм-продуцент E.coli рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. ИФА на основе упомянутого антигена, обладая высокой специфичностью, выявляла антитела в сыворотке крови больных коров в разведении 1:320 (К.Н.Мукантаев и соавт., 2011).

Одним из многообещающих подходов повышения специфичности ИФА является использование в этом тесте антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. «внутренних образов» исходного антигена. При этом, однажды полученные моноклональные антитела к специфичному эпитопу определенного возбудителя могут быть использованы для получения моноклональных АИАТ, которые в последующем заменят исходный антиген и исключают тем самым необходимость работы персонала патогенными микроорганизмами. АИАТ способны имитировать любые, в том числе слабоиммуногенные и слабоантигенные детерминанты гаптенов, полисахаридов, липидов, зачастую выделяемых в деградированной форме и, следовательно, лишенных части эпитопов, присущих нативной молекуле, или же сохраняющих высокую токсичность за счет особенностей экстракции. АИАТ, выступающие в роли белкового «заменителя» определенного бактериального антигена, позволяют устранять подобные препятствия и эффективно презентировать атоксичные детерминанты клеткам иммунной системы. Именно поэтому АИАТ в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве «суррогата» антигена или его отдельных детерминант для индукции протективного иммунного ответа против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов – возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Бесспорным преимуществом подобного подхода является отсутствие необходимости предварительного выделения изучаемой субстанции. Абсолютная специфичность МКА, использованных для получения АИАТ, предопределяет их гомологию исходному антигену.

Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина были получены АИАТ к идиотипу Ат2-бета моноклональных антител, направленных на поли-Б антиген бруцелл (С.Г.Оспанова и соавт, 2009). Одним из критериев характеристики АИАТ как Ат2-бета по сообщениям ряда авторов, является способность их взаимодействовать с ксеногенными антисыворотками, специфичными к исходному антигену, так как только этот идиотип, несущий «внутренний образ» антигена, могут связывать специфические антитела. Поэтому изучалось взаимодействие моноклональных АИАТ с кроличьей поликлональной моноспецифической антисывороткой и поликлональной позитивной сывороткой крупного рогатого скота в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом, проявляли активность по отношению к указанным ксеногенным сывороткам в титрах от 1:1600-1:3200. Одним из значимых свойств Ат2-бета является их способность индуцировать синтез гомологичных антител третьего порядка (анти-АИАТ), направленных против исходного антигена. Для этой цели были проведены серии иммунизаций линейных мышей препаратами АИАТ. Сыворотки мышей исследовали в непрямом ИФА на наличие антител третьего порядка, способных взаимодействовать с исходным поли-Б антигеном бруцелл. Как показали результаты, полученные АИАТ при введении в организм животных способны стимулировать синтез антител третьего порядка (Ат3), направленных против исходного антигена. Таким образом, исследователями доказана возможность применения АИАТ в качестве антигена при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в ИФА.

Феномен антиидиотипии в диагностике кровепаразитарных болезней (пироплазмозов, анаплазмозов, нутталиозов, трипаносомозов) изучалась и Г.С. Шабдарбаевой и соавт. (2009). Ими установлено, что АИАТ к антигенам различных кровепаразитов, полученные в результате двукратной иммунизации лабораторных животных – кроликов, достаточно информативны, специфичны и их вполне можно использовать в качестве диагностикумов в таких серологических тестах, как РНГА и ИФА.

Иммуноферментный анализ с использованием F(ab)2-фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов был предложен Б.Б. Гнеденко и соавт. (2006). Ими проведено определение сывороточного содержания аутоантител к трем группам белков в норме и у пациентов с шизофренией с помощью стандартных методов и тест-систем с иммобилизованными F(ab)2-фрагментами АИАТ. Уровни аутоантител ко всем белкам у пациентов с шизофренией были выше, чем в группе контроля.

Е.С.Жилин и соавт. (2011) испытали поликлональные антиидиотипические иммуноглобулины и их конъюгаты с пероксидазой хрена в ИФА для выявления антирабических антител в сыворотках животных. В результате испытаний регистрировали положительные результаты со специфическими сыворотками в независимости от вида продуцентов антирабических антител при отрицательных результатах с нормальными и гетерологичными сыворотками. Чувствительность тест-системы в 2-4 раза превышала непрямой и конкурентный вариант ИФА.

Представляют большой интерес работы, посвященные проблемам адаптации ИФА тестов условиям практики за счет удлинения срока годности иммуноферментного конъюгата. При этом изучается возможность использования иммобилизованных ферментов, искусственно связанных с нерастворимым носителем и при этом сохраняющих свои свойства. Иммобилизованные ферменты в тысячи раз стабильнее свободных. Все это обеспечивает высокую экономичность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные препараты. Одним из существенных факторов, сдерживающих широкое использование ИФА на производстве, является непродолжительный срок годности иммуноферментного конъюгата (6-12 мес. при надлежащем хранении в холодильнике). А.С.Геогджаян и соавт. (2011) получили иммобилизованные ферменты и применили их в разработке диагностических тест-систем для выявления возбудителей инфекционных болезней. Технология получения иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активация пероксидазы хрена; включение фермента в липосомы (или иммобилизация на алюмосиликате); иммобилизация полученных препаратов с иммуноглобулинами; очистка от не связавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. В качестве носителя необходимо было выбрать такой, который бы не препятствовал проникновению к нему субстрата и не лишал фермент подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции. Иммобилизованный в липосомах материал оказывается защищенным липидной мембраной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности. Исследователями определены оптимальные условия получения высокостабильных и специфичных иммобилизованных иммунопероксидазных конъюгатов при использовании в качестве носителей липосом и алюмосиликата. Показана перспективность иммобилизации носителей с ферментом и иммуноглобулинами. Иммунопероксидазные конъюгаты апробированы при ИФА на гомо- и гетерологичных штаммах возбудителей туляремии и лептоспироза. Срок годности разработанных препаратов увеличивается до 5 лет для липосомных и до 3 лет для алюмосиликатных иммунопероксидазных конъюгатов без снижения чувствительности и специфичности.

Заслуживают внимания практиков и методы диагностики инфекционных болезней, основанные на иммунохроматографии. Так, Н.А.Бызовой и соавт. (2010) предложена иммунохроматографическая детекция клеток Mycobacterium tuberculosis. Разработаны конкурентный и «сэндвич» варианты иммунохроматографического анализа, в которых контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами непосредственно инициируют движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимическое взаимодействие и формирование визуально детектируемых окрашенных зон. Показано, что и конкурентный, и «сэндвич» варианты метода позволяют определять клетки возбудителя туберкулеза в концентрации до 10 тыс. кл./мл (50-100 кл. в пробе). Преимуществом «сэндвич» анализа является возможность качественной визуальной диагностики, когда окрашивание аналитической зоны независимо от его интенсивности свидетельствует о положительном результате анализа.

Жердев и соавт. (2010) разработали иммунохроматографический способ определения антител к возбудителю туберкулеза. Для детекции антител используют два антигенных реагента – иммобилизованный в аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена возбудителя с частицами коллоидного золота. Комплексы определяют визуально или с использованием оптического детектора.

ИФА, особенно его точечный («dot») вариант, достаточно широко используют в диагностике таких паразитарных заболеваний, как амебиозы, бабезиозы, фасциолезы, лейшманиозы, гиподерматоз, эхинококкоз и токсоплазмоз. Эта реакция имеет очевидные преимущества перед другими иммуноферментными тестами, прежде всего, в возможности проведения большого числа анализов при значительно меньших объемах исследуемого образца, расходуемых реактивов, материалов и иммунореагентов. Антитела или антигены в иммунодоте наносятся в минимальных количествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью на единицу площади, чем носители с гладкой поверхностью, используемых в панельных тестах. С другой стороны, при проведении иммунодота можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно в период массовых исследований в полевых условиях. В.Г.Бережко и соавт. (2009) испытали точечный ИФА в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза свиней. Специфичность иммунодота при первой инвазии составила 97,4%. Наибольшее количество ложноположительных ответов регистрировали у свиней с естественной инвазией E.granulosis . По мнению авторов, с одной стороны, такой результат можно объяснить наличием общих для трихинелл и эхинококков белковых эпитопов, а с другой – он мог быть спровоцирован различными заболеваниями печени, при которых ложноположительные ответы наблюдают на антигены самых различных возбудителей. Специфичность иммунодота при эхинококкозе составила 68%. Основная причина ложноположительных результатов с сыворотками крови свиней, инвазированных C.tenuicollis , - близкое антигенное родство этого паразита с E.granulosis доказано иммунохимическим методом.

В течение последних трех лет (2009-2011 гг) НИР ученых-биотехнологов нашего университета была направлена на совершенствование методов диагностики заразных болезней животных, таких как лейкоз, эхинококкоз и описторхоз. Выбор названных болезней является неслучайным. Анализ эпизоотической ситуации показывает, что лейкоз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах с высокоразвитым молочным животноводством. Инфекция наносит большой урон селекции и племенной работе, сокращает сроки эксплуатации животных, снижает молочную продуктивность, качества молока и мяса. По данным ветеринарной отчетности племенных хозяйствах Казахстана доля скота, положительно реагирующего на лейкоз доходит в среднем до 6%. Оздоровительные мероприятия основаны на своевременном выявлении и изоляции из стада инфицированных животных. Однако РИД и ИФА, наиболее чаще используемые для этой цели, не всегда дают объективные результаты. Первый тест имеет низкую специфичность, а второй из-за своей высокой чувствительности могут давать ложноположительные реакции в случае использования недостаточно очищенного антигена вируса.

В этой связи перед нами была поставлена задача разработать тест-систему ИФА, позволяющей по ходу анализа избавляться от нежелательных компонентов вируссодержащего материала, и тем самым способствующей сенсибилизации твердой фазы антигенами, специфичными для возбудителя лейкоза. С целью придания тест-системе такого селективного свойства, т.е. свойства отделять специфичный антиген от балластных веществ, были испытаны МКА - один из популярных на сегодняшний «инструментов» иммунологов.

Продуцентами МКА явились штаммы культивируемых клеток мышей, полученные нами методом гибридомной техники. Создание штаммов-продуцентов с желаемыми свойствами - дело не из легких, но, как показывает мировая практика, однажды полученные штаммы, позволяют с лихвой окупить все расходы, предоставляя исследователям весьма ценные препараты - однородные антитела со строгой специфичностью.

Иммунизацию линейных мышей проводили гликопротеидным gp51 и полипептидным p24 антигенами вируса лейкоза. В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками получены 3 штамма гибридных клеток, синтезирующих МКА к полипептидному антигену и 6 штамма гибридом, продуцирующие антитела к гликопротеидному антигену вируса.МКА, полученные в результате культивирования штамма-продуцента в брюшной полости сингенных мышей, характеризовались высокой активностью и аффинностью по отношению к исходным антигенам.В наших исследованиях МКА были испытаны в качестве лиганды для фиксации вирусспецифического антигена к твердой фазе при постановке «сэндвич» ИФА.

Лунки планшет сначала сенсибилизировали МКА, пассировали активные центры полистирола, затем вносили вируссодержащий материал. При этом антитела избирательно связывались с теми антигенами, которые в своем составе имели специфичные для них эпитопы. Отмыв лунки планшет от не связавшихся компонентов, вносили образцы сыворотки крови или молока коров. При наличии в исследуемых пробах противовирусных антител, последние связываются с другими эпитопами антигена, фиксированного к твердой фазе посредством антител, образуя иммунный комплекс. Этот комплекс выявляли с помощью антибычьего конъюгата. В результате многочисленных опытов нами были определены оптимальные параметры и условия постановки ИФА для диагностики лейкоза.

По своей диагностической ценности наш метод не уступал коммерческим ИФА тест-системам. Итоги исследований легли в основу лабораторного регламента изготовления и применения компонентов диагностического набора. Метод скрининга поголовья крупного рогатого скота на маркеры вируса лейкоза на основе выявления интегрированного генома возбудителя в крови был разработан сотрудниками НЦБ РК (Е.Б.Евтыхова и соавт., 2011). Образцы выделенной из крови ДНК были протестированы на наличие провируса методом мультиплексной ПЦР с использованием смеси праймеров нацеленных на ген env и на фрагмент гена актина (внутренний контроль амплификации). Детекцию амплификаторов осуществляли электрофорезом в 2%-геле агарозы. Учеными этой же научной организации (К.К.Муканов и соавт., 2011) разработана ИФА на основе рекомбинантного р24 антигена вируса для серологической диагностики лейкоза.

Среди паразитарных болезней животных наибольшую тревогу вызывает эхинококкоз, так как эта болезнь наносит не только экономический, но и социальный ущерб. Люди заражаются при непосредственном контакте с собаками – пораженными половозрелыми эхинококками Echinococcus granulosis, а также при поедании овощей и плодов, загрязненных яйцами гельминта. При этой инвазиив печени, реже в легких и других органах промежуточных хозяев (с.х.животные и человек) образуются множественные кистозные образования, содержащие личинки паразита.Лечение больных животных не разработано. В редких случаях отмечается самовыздоровление животных с образованием обызвествленных эхинококковых пузырков. По клинической картине диагностировать болезнь весьма трудно. Иногда используют серологические реакций, основанные на обнаружении антител в сыворотке крови животных, такие как реакция сколекспреципитация, непрямая гемагглютинация, РДСК, а также аллергический метод. Однако, ни один из них не нашел применения в ветеринарной практике в силу низкой специфичности. Это и понятно – в этих тестах используется сложнейшая смесь антигенов гельминта. Одним словом, для искоренения болезни нужны достоверные методы диагностики, позволяющие своевременно выявлять и выбраковывать больных животных с последующей утилизацией зараженных органов под контролем ветеринарных специалистов.

В своей работе мы использовали четыре вида антигена: содержимое эхинококкового пузыря, протосколексы (продукт герминативной оболочки, свободно плавающий в полости капсулы), стенка пузыря и экскреторно-секреторный антиген (ЭС-АГ), выделяемый протосколексами в питательную среду в результате моделирования инвазии in vitro. Все антигены в РИД и ИФА активно взаимодействовали с антителами сывороток крови, полученных от животных с эхинококкозными поражениями. Для дальнейшей работы мы отобрали ЭС-АГ по следующим соображениям. Во-первых, белковый состав продукта жизнедеятельности эхинококка, культивируемого в искусственной питательной среде, намного проще, чем у других видов антигенов, во-вторых, методику получения антигена в условиях in vitro можно стандартизировать, и, в третьих, в случае выздоровления животных с образованием обызвествленных пузырков, естественно, прекращается иммунный ответ организма на метаболиты паразита.

Протосколексы были получены из эхинококковых пузырей животных во время убоя. ЭС-АГ гельминта выделяли в результате культивирования протосколексов в жидкой питательной среде. Антиген состоял из 11 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-63 кД. Методом гибридомной техники были получены штаммы клеток, продуцирующие антитела к детерминанте экскреторного белка с молекулярной массой 21 кД, и изучены их свойства.

Принцип обнаружения сывороточных антител, специфичных к эхинококкам, был основан на применении МКА в качестве первых антител в «сэндвич» ИФА. Эти антитела избирательно взаимодействуя с ЭС-АГ способствовали сенсибилизации твердой фазы метаболитами гельминта. Как показали результаты производственного испытания, во всех случаях обнаружения паталогоанатомических изменений, характерных для эхинококкоза, выявлялись и специфические антитела в образцах сыворотки крови.

Результатылабораторного и производственного испытания были использованы в разработке нормативно-технической документации на диагностическую тест-систему. Опытная партия диагностикума передана в МСХ для регистрации в государственном реестре ветеринарных препаратов.

ИФА, основанный на использовании в качестве антигенов - продуктов жизнедеятельности гельминта, был испытан нами для иммунодиагностики и другой инвазионной болезни - описторхоза - широко распространенного природно-очагового паразитарного заболевания человека, вызываемое гельминтом Opisthorchis felineus.

Гельминт локализируется в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе. Заражение человека и плотоядных животных - окончательных хозяев данного паразита, происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками гельминта рыб семейства карповых. Болезнь протекает хронически, без выраженных клинических признаков, не всегда в образцах фекалия пациентов, больных описторхозом, обнаруживаются яйца гельминта. Предложен аллергический метод, который, как и другие тесты, основанные на повышенной чувствительности замедленного типа, часто дает фальшрезультаты.

Для извлечения ЭС-АГ описторхиса сначала выделяли метацеркарий из поверхностных и глубоких спинных мышц рыб, обитающих в водоемах бассейна озера Тенгиз и реки Иртыш. Надо отметить, что степень зараженности рыб была довольно высокой, и у отдельных видов она достигала 26%. Затем заражали лабораторных животных (собак, кроликов и хомяков) метацеркариями. По истечении 60 суток животных забивали, изолировали половозрелые гельминтыи культивировали их в неполной среде Игла для накопления метаболитов.

Методом гибридомной техники получены два штамма-продуцента, МКА которых показали высокую активность по отношению к исходному антигену.

При разработке метода ИФА-диагностики описторхоза нами определялась возможность использования МКАкакв качествеагента,фиксирующего антиген описторхиса к твердой фазе, так и в роли антител, вступающих в реакцию с циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК) сыворотки крови, состоящими из молекул специфического иммуноглобулина и антигена. По данным литературы, на поздних стадиях болезни антитела, активные центры которых заняты антигенами паразита, не выявляются в серологических реакциях. Такие иммунные комплексы могут быть определены другими антителами, специфичными к свободным эпитопам антигена.

Предлагаемые тест-системы апробировались на образцах сыворотки крови людей, заведомо больных описторхозом в сравнении с коммерческой тест-системой Описторх-IgG-ИФА АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оба варианта ИФА дали вполне сопоставимые результаты как между собой, так и со сравниваемым аналогом.

Экспертиза продуктов животного происхождения на наличие в них остаточного количества антибиотиков или других биологически активных веществ становится одной из важных задач практической ветеринарии в связи с вхождением Казахстана в Таможенный союз и предстоящим вступлением его в ВТО. Присутствие контаминантов вызывают у людей аллергические реакции, дисбактериоз и другие патологии. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд методов. Наиболее широкое применение нашел микробиологический метод. Несмотря на относительную надежность, метод имеет ряд существенных недостатков. К ним относят низкий уровень чувствительности и воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в лаборатории штаммов тест-микробов. В странах ЕС, США и Японии иммуноферментный анализ является рекомендованным методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения.

Получение антител к антибиотикам является трудновыполнимой задачей, поскольку по своей химической природе они являются гаптенами и не вызывают иммунный ответ. В этой связи в наших исследованиях антибиотики сшивались с высокомолекулярными носителями (БСА, овальбумин). Эти конъюгаты и служили антигеном в гибридомной технике. Осуществив семь слияний иммунных спленоцитов с миеломной линией клеток, нам удалось получить 3 штамма–продуцента антител к гидроксильной группе молекулы стрептомицина, и по 2 штамма, синтезирующие иммуноглобулины к антигенным детерминантам хлорамфеникола (левомицетина) и окситетрациклина.

Метод, предлагаемый нами дляопределенияостаточного количестваантибиотиков, основан на конкуренции свободного антибиотика, содержащегося в исследуемой пробе и антибиотика, иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за активные центры антител. Диагностическая ценность тест-системы для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции апробирована на пробах молока и мяса в сравнении с коммерческими аналогами.Результаты испытания свидетельствуют о возможности использования ее для экспресс-обнаружения антибиотиков в продуктах питания. Таким образом, ИФА имеет все основания для того, чтобы занять свою достойную нишу в лабораторной практике ветеринарии.

Контрольные вопросы:1. Расскажите об основных результатах научной работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина в области совершенствования диагностики инфекционных болезней животных; 2. Основные итоги работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина по совершенствованию методов диагностики инвазионных болезней; 3. Чем объясняется перспективность применения антиидиотипических антител в иммунодиагностике инфекционных болезней?

Лекция № 4