Молекулярная диагностика в медицине и ветеринарии

Одной из актуальных проблем современной медициныи ветеринарии является разработка методов экспресс-обнаружения возбудителей инфекционных болезней в организме человека или животных, а также в воде, продуктах питания, кормах, почве и других объектах внешней среды. Профилактику и лечения инфекционных болезней значительно облегчает ранняя и точная диагностика. Каждый из методов, используемых в медицине и ветеринарии для идентификации патогенного возбудителя, имеет определенные недостатки. Так, например, микроскопический метод, хотя и является простым и доступным, не позволяет разграничить под микроскопом сходные микроорганизмы; изоляция чистой культуры возбудителя с помощью бактериологического метода – бесспорное доказательство инфекционной болезни, однако он требует длительного времени и не выявляют тех возбудителей, которые плохо растут на искусственных питательных средах либо вообще не поддаются культивированию; серологический метод, диагностирующий болезнь на основе обнаружения в крови специфических к возбудителю антител, не всегда специфичен. В этой связи подходы молекулярно-генетической диагностики, основанные на методах обнаружения специфической ДНК возбудителя болезни в исследуемом материале, нацелены на устранение указанных принципиальных ограничений, и, следовательно, имеют большую практическую значимость.

Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольшого количества мишени; 3)достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антител к конкретному антигену (иммунологические методы), другой – на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации.

Наиболее распространенным иммунологическим тестом является иммуноферментный анализ (ИФА). В этой тест-системе ферментная метка может быть введена в ан­тивидовые или специфические антитела, либо в антиген, что зависит от схе­мы постановки анализа.

Существуетнесколько вариантов постановки ИФА. Широкое применение нашел метод при котором специфические антитела в исследуемом образце обнаруживаются с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов (конъюгата). Принцип ИФА в данном случае заключается в специфическом взаимо­действии конъюгата с антителами к испы­туемому антигену, в результате чего достигается индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело. Антивидовые иммуноглобулины, конъюгированные ферментом, пред­ставляют собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, по­лученной иммунизацией животных-продуцентов иммуноглобулинами быка, кролика, мыши и других животных, меченную энзимами. В качестве твердой фазы используются полистироловые планшеты.

Антиген в ИФА можно обнаружить и с помощью меченных специфических анти­тел. Данный метод используется для определения антигенов, имеющих не­сколько детерминант. Возможность одновременного связывания антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и той же молекулы антигена. Название метода «сэндвич» обусловлено тем, что в про­цессе анализа антиген как бы «зажат» между антителами. Суть метода заключается в следующем. К твердой фазе с иммобилизированными антителами добавляют ан­тиген. Затем проводят отмывку носителя от несвязавшихся компонентов и вносят меченные энзимом иммуноглобулины. После удаления из­бытка конъюгата определяют концентрацию метки, связанной с твердой фазой с помощью субстрата для данного фермента.

В «сэндвич» методе могут применяться и антивидовые конъюгаты. При этом антиген, связанный с адсорбированными антителами, вступает в реак­цию со специфическими немеченными иммуноглобулинами, которые в даль­нейшем выявляются антивидовым конъюгатом, т.е. процедура исследований увеличивается на один этап. При постановке ИФА по указанной схеме следу­ет испытать антитела, полученные от разных видов животных с целью пре­дотвращения реакции иммобилизованных антител с антивидовым конъюга­том.

Метод «сэндвич» может быть использован для обнаружения перекре­ста антител. Для этого сначала лунки покрывают антигеном, после чего добавляют антитела, которые специфично с ними связываются. Из­быток антител отмывают и добавляют антиген, сшитый с ферментом. Ес­ли связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном, то свя­занный с ферментом антиген будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет определяться как увеличение поглощения в резуль­тате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сывороток с двумя препаратами идиотипа, а также для обнаружения анти-антиидиотипических антител. Возможно и другие варианты взаимного распо­ложения антител и антигена. Наличие в «сэндвич» дополнительных слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает уве­личение фона и вариабельность получаемых результатов.

Следующий вариант, получивший название конкурентный ИФА, позволяет выявлять антиген в образцах с помощью этого же антигена, меченного ферментом. Сущность метода заключается в следующем. К иммобилизованным антителам добавляют исследуемый образец и комплекс антигена с фермен­том. При этом происходит конкуренция определяемого и меченного антиге­нов за антидетерминанты антител. Через некоторое время конъюгат перерас­пределяется между раствором и носителем. Концентрация метки, измеряемая на твердой фазе, пропорциональна исходному содержанию исследуемого ан­тигена. Метод прост и быстро выполним, однако имеется трудность в полу­чении конъюгатов антиген-фермент.

В некоторых случаях химическая модификация фермента сопровожда­ется ухудшением его активности, а антигена - снижением способности фор­мировать прочный комплекс с антителами. В таких случаях определенный интерес представляет вариант ИФА в котором используются нековалентные комплексы фермента маркера с антителами. Наиболее эффективным подходом является включение ферментной метки через комплекс авидин-биотин. Он основан на использовании авидина - компонента яичного белка (мол.м. 66000) и биотина - витамина (мол.м. 228) образующих комплекс, константа связывания которого в десятки тысяч раз превышает прочность связи антиген-антитело.

Адсорбированный антиген выдерживают с образцом, содержащим ан­титела, отмывают и вносят антивидовые иммуноглобулины, ковалентно свя­занные с биотином. Добавляют авидин, меченный пероксидазой, образую­щий прочный комплекс с биотином, удаляют излишек конъюгата и после введения в систему субстрата определяют концентрацию антигена.

Одним из практичных и весьма чувствительных вариантов ИФА является пероксидазный тест. Сущность метода заключается в соединении иммунопероксидазного конъюгата со специфическим антигеном и определении образовавшегося комплекса с помощью диаминобензидинового реактива. В ветеринарии он более широкое применение находит в диагностике вирусных инфекций (бе­шенства, ящура и др.). Пероксидазный тест, как твердофазный ИФА, прово­дится в двух вариантах; прямой и непрямой. Последний чувствительнее, чем первый и не требует набора специфических иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, против антигена. Выбор пероксидазы в качестве метки анти­тел объясняется тем, что ее молекулярная масса меньше, чем у других фер­ментов, используемых в иммуноферментном анализе. Поэтому иммунопероксидазный конъюгат лучше проникает сквозь клеточную мембрану.

Метод молекулярной гибридизации является первым тестом генетической диагностики в основе которого лежит использование так называемых ДНК-зондов, меченных изотопом, флюорохромом или ферментом. Последние представляют собой небольшой участок ДНК (или РНК), нуклеотидная последовательность которого специфична для определенного вида микроорганизма. При добавлении меченого зонда в образец, в котором содержится ДНК исследуемого микроорганизма, происходит комплементарное соединение нуклеотидных последовательностей. Образовавшийся комплекс в зависимости от вида использованной метки определяют радиоизотопным анализом, либо ИФА, либо реакцией иммунофлуоресценции. Здесь следует отметить, что метод ДНК-зонда позволяет выявлять нуклеиновые кислоты микроорганизмов при их довольно высокой концентрации.

Специфичность зондов может быть различной. Например, они могут дифференцировать два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрикцирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и сапрофитного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизирующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что используемые зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах (Б.Глик, Дж.Пастернак, 2002). ДНК-зонды получают и путем химического синтеза последовательностей нуклеотидов, ответственных за определенный признак микроорганизма.

В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети населения. Для выявления ДНК возбудителя, в качестве основы используются высокоповторяющиеся последовательности ДНК Plasmodium falciparum. С его помощью можно обнаруживать всего 10 пг очищенной ДНК паразита или 1 нг той же ДНК в крови больного. С помощью гибридизации можно выявлять практически любые болезнетворные микроорганизмы. На сегодняшний день получены и охарактеризованы ДНК-зонды большинства патогенных микроорганизмов, вирусов и простейших. В числе первых возбудителей «заслуживших» свои ДНК-зонды Legionella pneumophila (респираторная болезнь), Salmonella typhi (пищевые отравления), Campylobacter hyointestinalis (гастриты), а также энтеротоксический штамм Esherichia coli, Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза) Brucella abortus (возбудитель бруцеллеза) и др.

Молекулярную гибридизацию, как правило, проводят на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот. Например, можно провести гибридизацию с молекулами ДНК возбудителя, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, молока и в других материалах, а также в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом материале слишком мала, ее можно значительно увеличить. Применение молекулярно-генетических подходов, основанных на обнаружении молекул ДНК патогена путем амплификации (размножения) их специфических участков, является новым направлением в диагностике инфекционных заболеваний. В 1983 году K.Mulles из биотехнологической компании «Cetus Corporations» предложил многократно размножить ДНК выявляемого микроорганизма, содержащегося в исследуемом образце, а затем провести детектирование комплекса ДНК-ДНК. Данный подход позже получил название полимеразно-цепной реакции (ПЦР).

В основе ПЦР лежит многократное повторение циклов репликации ДНК. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при температуре 93-95 С происходит разделение комплементарных цепей двуцепочной молекулы ДНК (денатурация). Вторая стадия заключается во внесении в образец, содержащий ДНК выявляемого микроорганизма, пару праймеров, один из которых комплементарен одной цепи, а другой – противоположной. Праймеры – искусственно синтезируемые одноцепочные дезоксиолигонуклеотиды, состоящие, как правило, из 20-27 пар оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. При температуре 50-65 С протекает синтез полинуклеотидных цепей путем удлинения праймеров с помощью дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. В процессе реакции праймеры отжигаются на этих цепях и инициируют ферментативный синтез ДНК по направлению друг к другу. По окончании синтеза новые цепи двухцепочной ДНК плавят, отжигают те же праймеры и вновь осуществляют синтез ДНК. Повторяя 3 стадии 30-40 раз за 1,5-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК или РНК конкретного микроорганизма, т.е. нарабатывается нуклеиновая кислота в количестве, достаточном для ее визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле без использования радиоизотопов.

ПЦР имеет две главные недостатки: ложноположительные реакции, вызванные контаминацией фрагментами ДНК из ранее полученных продуктов (ампликонов), и ложноотрицательные, полученные в результате действия на Taq –полимеразу ингибиторов, присутствующих в биологических жидкостях и тканях. Кроме того, к недостаткам теста следует отнести и дороговизну реактивов, а также оборудования, используемых при ее постановке.

В 1989 г. A. Brisson-Noel et al. были впервые опубликованы результаты экспериментальной работы по отработке экспресс-диагностики туберкулеза методом ПЦР. Ими было исследовано 35 клинических образцов (мокрота, содержимое желудка, содержимое абсцесса, периферическая кровь), из которых только два положительных в ПЦР не соответствовали отрицательным результатам, полученным стандартными методами (микроскопия, бактериологический анализ).

ПЦР может оказать исследователям неоценимую помощь в дифференциации видов микобактерий. A. Bahrmand et al. (2000) при анализе 329 образцов мокроты методом ПЦР использовали праймеры, специфичные для М. bovis, и получили положительный результат в 274 случаях. 55 образцов, показавшие отрицательные результаты по ПЦР, были повторны исследованы праймерами, специфичными для атипичных видов микобактерий - М. fortuitum и М. kansasii. Наличие последних установлено в 21 (38%) образце. В данной работе микобактерии туберкулеза бактериологически были изолированы из 224 образцов.

Высокоэффективные тест-системы ПЦР, позволяющие обнаруживать возбудителя туберкулеза в разнообразных тканях и жидкостях организма, предложены сотрудниками ВГНКИ (Россия)). Испытания показывают, что ПЦР способна заменить все применяющиеся методы лабораторной диагностики болезни. Результат теста может быть получен через несколько часов, при этом не имеет значения загрязнение материала другими видами микобактерий и любой другой микрофлорой. Интерес представляет также определение возможности применения ПЦР для прижизненной диагностики туберкулеза и выявления бактериовыделителей.

ПЦР для детекции бруцелл была впервые применена D.Fekete et al. (1990). Позднее она была успешно использована для родовой и видовой идентификации этих микроорганизмов при исследовании клеточных лизатов бактерий. Шумилов К.В. и соавт. (1996) изучили чувствительность и родовую специфичность метода ПЦР (в варианте двухшаговой реакции с вложенными праймерами, комплементарными гену BCPR 31 Brucella по сравнению с бактериологическим. В качестве патологического материала были взяты пробы молока и крови, контаминированные культурой Brucella abortus 19 с концентрацией бруцелл 1 млрд. м.к./мл; образцы селезенки, печени от морских свинок, убитых через 20 дней после иммунизации их культурами (Brucella abortus 19 и 104М в дозе 1 млрд. м.к.) Установлено, что ПЦР, подтверждают все положительные результаты бактериологического метода, а с учетом данных исследований проб печени чувствительность первого была в 2 раза выше. Авторы приходят к выводу, то метод ПЦР специфичен и высокочувствителен и позволяет в течение одного рабочего дня определить наличие или отсутствие возбудителя в исследуемом материале.

В исследованиях А.Х.Найманова и соавт. (2004) ПЦР-система (senX3-regX3, RD2 и gyrB) позволяла идентифицировать М.bovis и M.tuberculosisот от других бактерий в 95,4-100% случаев. Результаты авторов свидетельствуют о том, что у экспериментально зараженных животных М.bovis может находиться в организме и в 83,3% случаев выделяться с мочой, но при этом возбудитель не обнаруживают в крови. Из патматериала таких животных рост культур М.bovis бактериологически выявляли в 33,3% случаев, а с помощью ПЦР не обнаруживали, хотя при исследовании ПЦР верхнего слоя питательной среды, засеянной суспензией обработанного патматериала, возбудитель туберкулеза выявляли в 100% случаев. В благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров ПЦР дала ложно-положительные показания в 16,3% случаев. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании патматериала от больных туберкулезом коров результаты теста были положительными в 42% случаев.

Н.И.Потапова и соавт.(2006) для создания ПЦР тест-системы подобрали две пары олигонуклеотидных последовательностей (TubF-TubR и BovF-BovR) и два зонда (TaqTub и TaqBov). Обе пары праймеров позволяли получать фрагменты размером 135 пар оснований. Пара праймеров TubF-TubR и зонд TaqTub специфичны гену, присутствующими только в геноме M.tuberculosisот, а пара праймеров BovF-BovR и зонд TaqBov комплементарны гену, имеющемуся в геномах М.bovis и M.tuberculosis. Данную тест-систему на основе ПЦР в реальном времени сравнили с тест-системой НПО НАРВАК – «гнездовой» ПЦР. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяла измерять количество амплифицированных фрагментов искомой ДНК непосредственно в ПЦР-пробирке во время и после окончания реакции. Метод основан на использовании молекул, способных флуоресцировать при определенной длине волны. Сравнительный анализ двух тест-систем показал высокую сходность результатов. При постановке ПЦР-РВ не было ложноположительных результатов, так как исключены стадия электрофореза и необходимость открытия пробирки после амплификации. Авторы предлагают использовать тест-систему для быстрой диагностики и типирования микобактерий в культурах и образцах биоматериала. Кроме того, в ходе одной ПЦР-РВ можно определить два вида возбудителя, что существенно сокращает время проведения анализа и делает этот метод незаменимым в лабораторной диагностике туберкулеза. Метод ПЦР-РВ был также разработан для диагностики гриппа птиц, который позволял специфически выявлять вирус различных подтипов, включая высокопатогенный H5N1 (В.Ю.Белоусов и соавт., 2008), для выявления ДНК (13-130 копий) вируса ларинготрахеита птиц (Е.В.Жолдыбаева и соавт., 2008) .

Н.Л.Тупота и соавт. (2010) в своих исследованиях из 40 проб материала рост кислотоустойчивых микроорганизмов в виде колоний, имеющих различный пигмент и скорость роста, отмечали в 22 случаях. В ПЦР также 22 пробы дали положительные результаты. При этом положительный сигнал при культуральном исследовании на наличие микобактерий совпал с таковым ПЦР в 17 случаях и в 5 не подтвердился. Возможно это следствие роста микроорганизмов, сходных с микобактериями (нокардии, родококки и коринебактерии), и вызывающие ложноположительные результаты культивирования. Пять проб положительных в ПЦР, выделением культуры рода Mycobacterium и биопробой подтвердить не удалось. Это явление авторы объясняют существованием эпизоотически значимой части популяции возбудителя в виде «измененных» покоящихся форм, сенсибилизирующих организм животных к ППД-туберкулину для млекопитающих, но не способных к культивированию и, следовательно, не обнаруживаемых с помощью традиционных бактериологических методов.

Самым существенным фактором, обеспечивающим успешное лечение больных туберкулезом людей, является контроль за эффективностью действия лекарственных препаратов. По данным С.Н.Радюк и соавт. (1998) метод ПЦР оказался одним из самых эффективных для оценки терапии. Так, например, после проведенной терапии, в то время как результаты культурального и микроскопического методов были отрицательными, путем ПЦР удалось обнаружить возбудителя туберкулеза в 27% образцов через 2 мес. после начала лечения, в 13% - через 3 мес и 7% 0 – через 6 мес лечения. Метод оказался полезным и для быстрого определения антибиотикоустойчивости клинических изолятов. В общей сложности, согласно данным литературы, обнаружены 7 генов, ассоциированных с антибиотикоустойчивостью у M.tuberculosis.

Тест-система для выявления микроорганизмов из рода Brucella методом ПЦР («ГЕН-БРУ») была разработана РосНИПЧИ «Микроб». А.А.Павловым (2002) была изучена эффективность данного диагностического набора в сравнении серологической диагностики бруцеллеза. Показано, что ПЦР превосходит по чувствительности РА и РСК в 2-2,4 раза. Выявлено, что наибольшая чувствительность ПЦР анализа достигается при использовании в качестве диагностического материала образцов крови животных. Установлена возможность детекции ДНК вакцинного штамма B.abortus 82 в поздние сроки после иммунизации, что свидетельствует о его длительной приживаемости в организме вакцинированных животных. Доказано, что данная тест-система может быть применена для обнаружения ДНК бруцелл в молоке, как метод оценки санитарного благополучия пищевых продуктов животного происхождения.

О.Д.Скляровым и соавт.(2004) разработана тест-система «БРУ-КОМ», основанная на применении ПЦР, которая позволяет выявлять ДНК бруцелл всех видов в молоке, крови, сперме, внутренних органов и лимфатических узлах инфицированных животных. Испытание ПЦР показало, что она достоверно превосходит по чувствительности бактериологический метод. Для диагностики бруцеллеза методом ПЦР авторы рекомендуют исследовать пробы нескольких объектов (примерно 5-6 крупных парных лимфатических узлов, селезенки и печени), так как изучение отдельных из них может отразиться на достоверности результата. Л.Ф.Зыкин и соавт. (2004) апробировали ПЦР-Иерсэнтеро амплитест, производимой фирмой «Ниармедик плюс» (Москва). Праймер, специфичный для фрагмента гена опреона Н Y.enterocolitica, размер 324 п.н. Как показали результаты, ПЦР была в два раза информативнее бактериологического метода, и в этой связи рекомендованы исследователями для индикации возбудителя кишечного иерсиниоза в молоке коров.

Т.В.Гребенниковой и соавт. (2004) разработана диагностическая тест-система на основе ПЦР для определения и дифференциации лейкоза типов A,B,C,D,E и J , а также показана возможность оздоровления поголовья птиц после своевременной диагностики и изоляции здоровых особей. Н.С.Юдин и соавт. (2008) для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах использовали ПЦР. Используемые праймеры были специфичны для последовательности оболочного гена env . Процент соответствия между РИД и ПЦР составлял 31%. При этом, 25 животных, позитивных по методу РИД, были ПЦР-негативными, в то время как 22 РИД-негативных животных были ПЦР-позитивными. Авторы рекомендуют ПЦР в качестве дополнительного метода для ранней диагностики лейкоза. Н.В.Кузнецова и соавт., используя ПЦР для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, пришли к заключению, что эту реакцию можно использовать для определения источника инфекции в стадах, при племенной продаже, профилактике и на заключительных этапах искоренения инфекции. По данным авторов, у животных с незначительно повышенными морфологическими показателями крови ПЦР позволяет достоверно отличать лейкемоидное состояние организма от ранней стадии лейкозного процесса. В.Л.Зайцевым (2005) отработан метод ПЦР для обнаружения вирусов оспы овец, контагиозной эктимы овец и коз, ящура в различных вируссодержащих материалах. Разработаны специфические праймеры, позволяющие проводить дифференциацию вирусов оспы овец и оспы коз. Тест наборы позволяли с высокой чувствительностью и специфичностью идентифицировать вирусы в количестве 2-5 пг геномной ДНК. По данным В.М.Строчкова и соавт.(2008) высокая степень чувствительности и специфичности ПЦР отмечается при использовании универсиальных праймеров LP3dAll и RP3dAll.

А.О.Семенцовой и соавт. (2011) для исследования биологических образцов от больных людей и животных, а также переносчиков (клещей и насекомых) на наличие в них генетического материала флавивирусных болезней (клещевой энцефалит, лихорадки Западного Ниля, желтой лихорадки, Японского энцефалита) был разработан лабораторный вариант мультиплексной ПЦР (позволяющая выявлять сразу несколько патогенов в одной пробирке) с регистрацией результатов в реальном времени. Таким образом, методы молекулярной диагностики как высокочувствительные и специфичные тесты могут найти свое практическое применение в ветеринарной медицине для своевременного выявления инфицированных животных и обнаружения патогенов в биоматериале или объектах внешней среды.

Контрольные вопросы: 1.Назовите преимущества молекулярной диагностики в сравнении с известными методами; 2. Расскажите о принципах постановки различных вариантов ИФА; 3. Чем отличается метод молекулярной гибридизации от полимеразно-цепной реакции (ПЦР)? 4.Расскажите о состоянии и перспективах использования ПЦР в ветеринарной практике.

Лекция №3