Биотехнология производства биопрепаратов и лекарственных веществ

До появления генной и клеточной инженерии многие лекарственные препараты удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных для применения на практике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано сотни генов различных белков, гормонов и ферментов человека и животных. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках хозяев, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных болезней и повышения продуктивности животных.

Бычий соматотропин (гормон роста крупного рогатого скота). Еще в 1930-х гг. было показано, что введение гормона роста коровам в значительной степени повышает их удойность. Поскольку получение природного гормона в больших количествах весьма трудоемко и дорого, он не нашел широкого применения в молочной промышленности. С помощью техно­логии рекомбинантных ДНК ген соматотропина был кло­нирован в Е. coli, синтезированный рекомбинантный гормон выделен из бактериальных клеток и очищен. Как и ожидалось, удой коров, которым был введен рекомбинантный препарат, уве­личился на 25—30%.

Соматотропин, содержащийся в молоке, был исчерпы­вающим образом проверен на безопасность. У коров, получавших рекомбинантный гормон, его концентрация в молоке была не выше, чем у контрольных животных. Более того, препарат неак­тивен в организме человека, и все тесты на ток­сичность не выявили никаких побочных эффек­тов. Используя все доступные результаты исследований, FDA пришла к выводу, что как мясо, так и молоко коров, получавших рекомби­нантный препарат, безопасны для человека. Это за­ключение поддержало Ведомство по оценке тех­нологий США после того, как был проведен независимый анализ многочисленных данных по тестированию бычьего соматропина. Тем не менее, рекомбинантный бычий соматотропин не был принят обществом с распростерты­ми объятиями. Одна мощная лоббирующая группа выступила единым фронтом за то, чтобы разре­шение к использованию рекомбинантного гормона, выданное FDA, было заблокировано. В основе ее действий лежали экономические соображе­ния, касающиеся последствий применения ре­комбинантного препарата для молочной промышлен­ности. Члены группы считали, что это приведет к разорению многочисленных мелких молочных ферм, поскольку для получения того же количе­ства молока понадобится меньше коров. Кроме того, высказывалась обеспокоенность, что мо­лочная промышленность будет монополизирова­на крупными корпорациями в ущерб интересам независимых производителей. По-видимому, эти экономические аргументы были обоснован­ными и уж, конечно, любая группа людей имеет право протестовать против того, что может представлять угрозу для ее существования. Од­нако основной причиной рекламной кампании, развернувшейся против использования соматотропина, послужило соображение, что «гормоны, полученные генноинженерными ме­тодами», могут нанести вред человеку и вызвать образование злокачественных опухолей. То, что для получения гормона роста использовалась технология рекомбинантных ДНК, еще более повысило эмоциональный накал.

Помимо экономических аргументов, против­ники соматотропина высказывали соображение, что его использование увеличит частоту бактериальных инфекций молочных желез (маститов) у коров. Это потребует применения большего коли­чества антибиотиков, что приведет к повыше­нию их концентрации в молоке и, в свою очередь, может вызвать аллергические реакции у людей, употребляющих такое молоко в пищу. Кроме того, повышение количества антибиотиков может привести к усилению давления отбора и к появлению устойчивых к ним патогенов. Однако Консультативный комитет по ветеринарии при FDA, проведя соответствующий анализ, пришел к выводу, что частота маститов у коров, получавших рекомбинантный соматотропин, не выше, чем у коров, не получавших этого препарата.

Рекомбинантный соматотропин был лицензирован в США для применения в молочной промышленности в 1994 г. Однако во многих других страна до сих пор существует временный запрет на продажу молока от коров, получающих такой гормон. По-видимому, этот запрет обусловливается социально-экономическими причинами, а не обеспокоенностью возможным влиянием данного препарата на здоровье людей.

Многие высказывавшиеся вначале опасения, связанные с производством и потреблением пищевых продуктов, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, постепенно рассеялись после того, как FDA и аналогичные организации в других странах обеспечили выполнение всех процедур, необходимых для оценки возможного риска от использования таких продуктов. Производители предпочитают, чтобы число тестов, которые должен пройти тот или иной продукт — начиная с этапа разработки и заканчивая поступлением на рынок, было минимальным. Двойная ответственность при этом ложится на правительственные организа­ции. Они должны заботиться об охране здоровья общества в целом и в то же время - об устране­нии лишних барьеров на пути внедрения новых разработок. Со временем, по мере накопления новых данных, жесткость существующих норм может быть ослаблена и приняты более простые тесты. Очень важно, чтобы все эти изменения не вводились для удобства, в ущерб безопасности.

Антибиотики относятся к вторичным метаболитам – низкомолекулярным соединениям, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста, т.е. в идиофазе, благодаря чему их еще называют идиолитами. Биологическая роль антибиотиков обозначаются ролью в обеспечении конкурентного существования в среде обитания, путем подавления жизнедеятельности других групп микробов.

Антибиотические вещества продуцируют в основном различ­ные группы почвенных микроорганизмов, относящиеся к актиномицетам, бактериям, мицелиальным грибам. Это сапрофиты, аэробы, гетеротрофы. Среди почвенных анаэробов, ацетоно-бутиловых, дисульфатирующих, пропионовокислых бактерий редко встречаются антибиотикопродуценты, поскольку конкурентная среда анаэробами создаётся путём накопления метаболитов брожения: бутанола, пропионовой, уксусной кислоты, этанола, а также за счёт про­дукции сульфидов, сероводорода и др. Продуценты антибиотиков отсутствуют и среди уксусно-кислых, тиоловых, метилотрофных бактерий. Эти аэробы как бы вне конкуренции, так как окружающие микроорганизмы не исполь­зуют их специфический субстрат либо не могут существовать в сильно кислых условиях, которые они создают.

Доминирующее положение среди продуцентов антибиотиков занимают актиномицеты. Известно более 4000 антибиотиков, продуцируемых этой группой микроорганизмов. Только один вид актиномицетов Str. griseus продуцирует около 50 антибиотических соединений.

Известно более 1000 антибиотиков бактериального происхож­дения, продуцируемые почвенными, спорообразующими бак­териями из рода Bacillus. Мицелиальные грибы являются продуцентами беталактамных антибиотиков - пенициллина и цефалоспорина, а также их полусинтетических производных. Основные продуценты грибы родов Penicillium, Cephalosporium (Acremonium).

Антибиотики, синтезируемые актиномицетами подразделяются на: тетрациклины (хлор-, окситетрациклины и их производные (доксициклин, метациклин) - Str. rimosus, Str. aureofaciens); аминогликозиды (стрептомицин - Str. griseus, неомицин - Str. fradiae; канамицин - Str. kanamyceticus и др.); макролиды (эритромицин - Str. (saccharopolyspora) erythraeus, олеандомицин - Str. antibioticus); ароматические соединения (хлорамфеникол - Str. venezuelae); полиеновые (амфотеррицин В, нистатин - Str. neurasei); рифамицины(рифамицин - Str. (Nocardia) mediterranei); антрациклины и противоопухолевые(блеомицин - Str. verticillius).

Тетрациклины, аминогликозиды, макролиды и ароматические соединения ингибируют трансляцию белка на рибосомах прокариот. Полиеновые антибиотики нарушают проницаемость цитоплазматической мембраны возбудителей лейкозов. Рифамицины ингибируют РНК - полимеразу бактерий. Антрациклины нарушают репликацию ДНК.

Бактерии продуцируют антибиотики пептидной природы: Bacillus brevis -грамицидин С, Bacillus polymyxa - полимиксин В, Bacillus licheniformis - бацитрацины. Пептидные антибиотики нарушают проницаемость цитоплазматической мембраны прокариот.

Мицелиальные грибы, продуцируют беталактамные антибио­тики и их производные, ингибирующие синтез пептидогликана -компонента клеточных стенок грамотрицательных и ,особенно, грамположительных микроорганизмов: пенициллины (пенициллин и их полусинтетические производ­ные, P. chrysogenum, P. notatum); цефалоспорины (цефалоспорин С и производные С.chrysoge­num, С.acremonium); цефамицины (цефамицин С, цефоксин и др.).

В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты. Следовательно, они нашли широкое применение в медицине и ветеринарии, пищевой и консервной промышленности, сельском хозяйстве. В медицинской и ветеринарной практике они используются при лечении человека и животных от всевозможных инфекций. В пищевой и консервной промышленности используется низин (Str. lactis) с целью консервирования пищевых продуктов. Низин кроме обычных аминокислот, содержит лизин, гистидин, пролин, метионин, изолейцин, а также редко встречающиеся серосодержащие альфа - лактионин и бета - метиллантионин. Подавляет рост стрептококка, стафилококка, бацилл. Добавление его к консервированным продуктам позволяет снижать температуру и продолжительность стерилизации и тем самым сохранить их вкусовые и питательные качества. В животноводстве как кормовая добавка, стимулятор роста применяются более 20 антибиотиков (биомицин, террамицин, гризин, флавомицин и др.).

Микробиологический синтез начинается с подготовки среды культивирования. Субстрат должен давать хороший рост микроба, должна быть дешевым и доступным. Среда стерилизуется предварительно в биореакторе влажным паром под давлением. Одновременно идет подготовка посевного материала, чистая культура штамма-продуцента наращивается последовательно в колбах, лабораторных и опытно-промышленных ферментерах. Следующая этап – это аэробная, глубинная, периодическая ферментация в течение 7-10 суток. В процессе ферментации поддерживается температура, рН, рО2, происходит постоянное перемешивание культуральной среды, используются химические и механические способы пеногашения. Затем проводится обработка ферментативной биомассы: фильтрация, если антибиотики в культуральной жидкости; если антибиотики в клетках, то осаждение антибиотиков в осадок вместе с клетками, потом их выделение из клеток. В процессе выделения и очистки антибиотиков используются методы экстракции, ионообменной сорбции, осаждения и т.д. Выделенный в гомогенном состоянии антибиотик высушивается при помощи распылительной или лиофильной сушки, стабилизируется с целью сохранения биологической активности, придается лекарственная форма.

Синтез новых антибиотиков.Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, уча­ствующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в хо­де которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганиз­ме двух немного различающихся путей биосин­теза антибиотика.

Одна из плазмид Streptomyces, рIJ2303, несу­щая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибио­тика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несу­щие части 32,5 т.п.н.-фрагмента (например, рIJ2315), вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезиурующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Tu22 S. violaceoruber, синтезирующие родст­венные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин.

Все указанные антибиотики являются кис­лотно-щелочными индикаторами, которые придают растущей культуре характерный цвет, зави­сящий от рН среды. В свою очередь рН (и цвет) среды зависят от того, какое соеди­нение синтезируется. Мутанты родительского штамма S. coelicolor, не способные синтезиро­вать актинородин, бесцветные. Появление ок­раски после трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. либо штаммов В1140 или Тu22 S. violaceoruber плазмидой, несущей все или не­сколько генов, кодирующих ферменты биосин­теза актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду pIJ2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tu22 S. vio­laceoruber плазмидой рIJ2303, наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик — дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomuces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый анти­биотик — медерродин А.

В структурном отношении эти новые анти­биотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда проме­жуточный продукт одного пути биосинтеза слу­жит субстратом для фермента другого пути. Когда будут детально изучены биохимические свойст­ва различных путей биосинтеза антибиотиков, появится возможность создавать новые уни­кальные высокоспецифичные антибиотики, ма­нипулируя генами, которые кодируют соответ­ствующие ферменты

Усовершенствование производства антибиотиков.С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимити­рующим фактором в промышленном производ­стве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культу­ры Streptomyces его часто оказывается недоста­точно, рост клеток замедляется и выход анти­биотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конст­рукцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не ис­ключают друг друга.

Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синте­зе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислороди доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорга­низма. После его экспрессии на долю гемоглоби­на Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Транс­формированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислоро­да (примерно 5% от насыщающей концентра­ции), синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганиз­мов, растущих в условиях недостатка кислорода.

Моноклональные антитела как лекарственные средства.Возможность использования радиоактивных МКА в терапии рака была впервые показана в 1979-80 гг при лечении больных с неоперабельным первичным раком печени (Медицинская школа Университета Джона Гопкинса, шт. Мэрилэнд). Такое лечение оказалось эффективнее обычной химио- и радиотерапии. Одним из эффективных противораковых препаратов растительного происхождения является рицин - токсин из семян клещевины. В условиях in vitro этот токсин разрушает не только раковые, но и нормальные клетки, так как они обладают способностью связываться с поверхностью любых клеток. Поэтому, необходимым условием является именно селективность связывания. Рицин по своей структуре как бы создан для выполнения такой задачи. Он состоит их двух полипептидных цепей: А-цепь несет токсические детерминанты, а В-цепь содержит участок, распознающий галактозу, что и позволяет рицину связываться с клеточной мембраной. В НИИ Клен-Миди в Монпелье (Франция) были очищены А-цепи рицина с целью конъюгирования ее с противоопухолевыми МКА. Без В-цепи рицин приобретал специфичность связывания благодаря антителам и не попадал в нормальные клетки (Casellas P. and Gros P., 1982). Такие иммунотоксины распознавали антигены, свойственные для некоторых опухолей мышей и новообразований человека. Доказано, чтобы убить здоровую клетку, нужно в 1000-100000 раз больше яда, чем для уничтожения раковой клетки. В экспериментах на животных иммунотоксины показали высокую избирательность действия и убивали злокачественные клетки in vitro.

МКА нашли применение в выделении биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. Одним из первых препаратов, очищенных с помощью МКА, был интерферон. При этом антитела пришивались к углеводным гранулам и использовались для приготовления колонки с иммуносорбентом, на котором очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через колонку с иммобилизованными МКА препарат очищался в 5000 раз.

МКА способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантанта, и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). Они нашли применение и в усилении действия лекарственных средств на клетки-мишени, устраняя при этом побочные явления, имеющие место при обычной химиотерапии рака. Например, МКА были встроены внутрь липосомных пузырков. Последние, пересекая клеточную мембрану, транспортируют молекулы лекарственного препарата до определенного органа (в соответствии со специфичностью связанных с ними МКА), где и оставляют свое содержимое.

Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Kажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблему, поскольку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов, многие терапевтические cpедства заведомо вводят в дозах, не достигают оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколько приемов: а) заключает его в особые частицы – липосомы, липидная оболочка которых имеет высокое сродство к нужным органам; б) встраивают гены специфических токсинов в инфильтрирующие опухоль лимфоциты, которые освобождают эти токсины непосредственно в опухоли; в) присоединяют молекулы лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, имеющимся на поверхности клеток, например опухолевых; г) используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Для того, чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки.

Для эффективной работы последней из описанных приемов необходимо, чтобы а) моноклональное антитело, связанное с ферментом, переводящим лекарственное вещество в активную форму, было в достаточной степени очищено и имелось в нужном количестве; б) связывалось с высокоспецифичным для клетки-мишени белком: в) было стабильным в физиологических условиях, но в то же время быстро выводилось из кровотока; г) при необходимости могло проникать в опухолевую ткань, обеспечивая действие препарата на все ее клетки. В этом случае мишенями оказываются строго определенные клетки, что позволяет использовать лекарственное вещество в гораздо меньших дозах, чем при прямом введении. Применение в такой системе моноклональных антител мыши может приводить к развитию иммунного ответа, поэтому очень важно использовать фрагменты антител человека или антител, максимально сходных с ними по структуре.

Приведем один пример из медицинской практики. Тромбоэмболия мозговых или сердечных артерий становится наиболее частой причиной смерти людей. Тромб состоит из молекул фибрина, фактора связывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются с помощью плазмина сериновой протеиназы, который образуется из плазминогена под действием активатора. Однако нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повышения уровня плазмина в крови было предложено использовать активатор плазминогена в качестве терапевтического средства.

Однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина фибриноген, и если уровень последнего врезультате терапии с использованием активатора плазминогена снизится слишком сильно, могут произойти обширные внутренние кровотечения. Это привело к необходимости создания тромболитических препаратов, разрушающих только фибрин в тромбе. Ученые исходили из того, что если к активатору плазминогена «пришить» антитело, специфичное к фибрину, то будет происходить только локальное повышение концентрации плазмина вблизи тромба. Для проверки этой гипотезы тканеспецифичный активатор плазминогена был присоединен к моноклональному антителу, специфичному в отношении фибрина. Испытания на модельных системах показали, что комплекс присоединялся к сгусткам крови и лизировал их, не вызывая значительного разрушения фибриногена. Были созданы и другие типы конъюгатов антитело—активатор плазминогена, тоже приводящие к локальному образованию плазмина, разрушающего кровяные сгустки. Несмотря на кажущуюся перспективность иммунотерапии, этот метод имеет и ряд ограничений, связанных с применением моноклональных антител мышей.

Применение МКА для лечения людей и сельскохозяйственных животных может привести к развитию аллергических реакций, поэтому очень важно использовать гомологичные иммуноглобулины. Мышиные МКА, как чужеродные белки, при многократном введении вызывают сенсибилизацию пациента. Создание видовых антител представляет собой довольно трудную задачу, поскольку получение антител человека или домашних животных путем традиционной гибридомной технологии сталкивается с рядом проблем (отсутствие эффективных клеточных линий миеломы, иммунизация человека не проводится по соображениям этического характера и др.).

Для получения гибридом сельскохозяйственных животных необходимо иметь перевиваемые линии миеломных клеток, полученных от определенного вида скота. Описаны различные плазмоцитомы лошадей, коров, свиней, а также собак, кошек и кроликов (P.Pastoret, 1982), однако они не отвечают тем требованиям, предъявляемым для миеломных клеток. Например, известные до сегодняшнего дня перевиваемые линии сельскохозяйственных животных не имеют стабильных маркеров, обусловленных с генной мутацией клеток. Поэтому некоторыми исследователями проведена работа по получению гетерологичных МКА путем слияния мышиных плазмоцитомных клеток с лимфоцитами домашних животных. Так, S.Sricumaran et al.(1983) получили гибриды из миеломы мыши и лимфоцитов быка, продуцирующие иммуноглобулины в большей степени похожие на Ig крупного рогатого скота. Описаны гибридомы мышь+бык, синтезирующие МКА против К99 антигена E.coli (D.V.Anderson et al., 1987) и коронавируса крупного рогатого скота (T.J.Raybould et al., 1985). D.J.Groves et al., (1987) получили гибридому мышь+овца, продуцирующую МКА к тестостерону, а T.J.Raybould et al.(1984) описали гибридому мышь+свинья.

K.H.Nielsen and M.D.Henning (1989) путем слияния лимфоцитов периферической крови иммунизированной коровы с плазмоцитомой мыши получили гибридому-продуцента МКА крупного рогатого скота против липополисахаридов Brucella abortus. Антитела, вырабатываемые межвидовой гибридомой, слабо агглютинировали клетки бруцелл при нейтральном рН, однако в кислой среде их агглютинобельность заметно повысилась. Эти антитела не преципитировали ЛПС в РИД, однако проявляли активность в РСК и непрямом ИФА, хотя не могли конкурировать с гомологичными мышиными МКА. Тем не менее, межвидовые гибридомы, как и следовало ожидать, оказались не стабильными в части продуцирования МКА. Следовательно, для получения гомологичных для человека и животного МКА необходимо разрабатывать другие подходы.

Производство антител с помощью Е. coli. Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода «биореакторов» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие Fc-фрагмента антитела необязательно.

Суть методики получения функциональных антител с помощью Е. coli состоит в следующем: используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов), синтезируют кДНК. Затем проводят раздельную ПЦР-амплифицикацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. После чего амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага l. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. Далее, кДНК одной Н- и одной L-цепи встраивают в общий «комбинаторный» вектор, так что в бактериофаге синтезируются обе цепи и образуется «полноценный» Fv-фрагмент. Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага l, поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности.

На этапе соединения кДНК Н- и L-цепей в одном векторе образуется широкий спектр генов различных антител. Некоторые из них кодируют уникальные сайты связывания, получить которые с помощью обычной гибридомной технологии было бы невозможно. Пул антител млекопитающих включает 10⁶—10⁸ разных антител. Фаговая библиотека содержит примерно столько же клонов, поэтому можно ожидать, что одна комбинаторная библиотека будет вырабатывать такое же количество различных антител (Fv-молекул), как любое млекопитающее. Кроме того, однажды создав исходную комбинаторную библиотеку, можно комбинировать L- и Н-цепи и получать Fv-фрагменты, распознающие необычные эпитопы. Еще большего разнообразия можно достичь, используя неспецифический мутагенез. Поскольку за относительно короткое время можно провести скрининг миллионов фаговых бляшек, идентификация Fv-фрагментов с нужной специфичностью занимает от 7 до 14 дней. Для сравнения: скрининг нескольких сотен гибридомных клеточных линий обычно занимает месяцы.

Векторы на основе бактериофага l не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. coli. Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. coli образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностических, так и в терапевтических целях.

Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ИФА. Суть метода состоит в следующем: образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окрашивает те ячейки, в которых находятся фаговые частицы, несущие антитела, к антигену-мишени. Выделив фаг, синтезирующий желаемый фрагмент антитела, можно экстрагировать кодирующую этот фрагмент ДНК и субклонировать ее в экспрессирующем векторе. Таким образом, методы биотехнологии открывают новые обнадеживающие перспективы в создании уникальных лекарственных средств и биопрепаратов для нужд медицины и ветеринарии.

Контрольные вопросы: 1. Назовите причины, сдерживающие применение в животноводстве гормона роста крупного рогатого скота? 2.Какие антибиотики, синтезируемые актиномицетами, нашли широкое применение в ветеринарии и животноводстве? 3. Расскажите о современных подходах в технологии производства антибиотиков; 4.Приведите примеры использования моноклональных антител в терапевтических целях; 5. Получение моноклональных антител с помощью кишечной палочки.

Лекция №6