Клонирование гибридомных клеток 1 страница

Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гипоидные клетки.

К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуориметра.

46. Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов и живых гибридных носителей. Технологические схемы производства вакцин и сывороток.

Субъединичные вакцины состоят из фрагментов антигена, способных обеспечить адекватный иммунный ответ. Эти вакцины могут быть представлены как частицами микробов, так и получены в лабораторных условиях с использованием генно-инженерной технологии.

Примерами субъедиинчных вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae и вакцина против менингококка типа А.

Рекомбинантные субъединичные вакцины (например, против гепатита B) получают путем введения части генетического материала вируса гепатита B в клетки пекарских дрожжей. В результате экспрессии вирусного гена происходит наработка антигенного материала, который затем очищается и связывается с адъювантом. В результате получается эффективная и безопасная вакцина.

Вектор, или носитель, - это ослабленные вирусы или бактерии, внутрь которых может быть вставлен генетический материал от другого микроорганизма, являющегося причинно-значимым для развития заболевания, к которому необходимо создание протективного иммунитета. Вирус коровьей оспы используется для создания рекомбинантных векторных вакцин, в частности, против ВИЧ-инфекции. Подобные исследования проводятся с ослабленными бактериями, в частности, сальмонеллами, как носителями частиц вируса гепатита B. В настоящее время широкого применения векторные вакцины не нашли.

54.Области применения моноклональных антител. Характеристика.

Можно использовать моноклональные антитела и в качестве меток для точной идентификации специализированных клеток, например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, позволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность.

Кроме того, можно создавать высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных вирусных штаммов и паразитов. Моноклональные антитела способны также к нейтрализации лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клеткимишени, позволяя избегать серьезных побочных явлений, весьма обычных, например при химиотерапии рака.

Самыми важными областями использования иммунохимического анализа являются:

•контроль банков крови и продуктов из донорской крови;

•обнаружение возбудителей в объектах внешней среды;

•диагностика инфекционных заболеваний;

•диагностика диабета.

Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство иммунодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоятельную область биотехнологической промышленности.

47. Культуры растительных клеток. Методы культивирования. Лекарственные препараты, получаемые из каллусных и суспензионных культур.

В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном состоянии, морфологическая "выравненность", удовлетворительная скорость размножения, сохранность путей метаболизма. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или агломерирующихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в агломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в-некотором приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика—время удвоения их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатноё (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые илитяарлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию воробейника (Lithospermum erythrorbizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем. За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм.

48. Культуры животных клеток. Методы культивирования.

Любые клетки животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки, которая со временем развивается и дифференцируется.

Зародышевый диск включает эктодерму, эндодерму и мезодерму, из которых впоследствии образуются все ткани макроорганизма. Но как только какую-либо ткань перевести в культуру, то наступает дедифференциация клеток и различить их становится делом трудным или невозможным, и поэтому регистрацию их ведут почти исключительно по происхождению. Например, для исследования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки получены от больных раком легкого и щитовидной железы. В 1986 г. в Японии впервые получен в культуре штамм клеток рака желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей in vitro, сохранил прежнее число хромосом в пределах 76—101. Индуцируемый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм оказался полезным при оценке противоопухолевых средств.

Любой штамм, представляющий определенную ценность для научно-практического использования, должен иметь следующие характеристики:

1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для опухолевой необходим показатель доброкачественности или злокачественности),

2)тип ткани — эмбриональная или зрелая,

3)принадлежность ткани — вид животного,

4)источник ткани — орган,

5)тип клетки (если известно),

6)наименование штамма (буквенное — не более 4 букв и серия цифр нумерации),

7)номер клона, если штамм клонировался,

8)источник информации (ссылка на оригинальную публикацию).

Все способы выращивания клеток животных могут быть соотнесены либо к интактным (нетрансформированным с помощью вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех культивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякорива-ния" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика. Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах.

Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хорошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии.

Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами.

Глубинное выращивание клеток в монослое.Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков — фибронектинов (от лат. fibra — нить, nectere — связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. В животном организме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбрионального развития, при заживлении ран), и связанные с базальными мембранами, содержат на своей поверхности крупномолекулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого в 1973 г. Р.О.Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.-И. Хакомори (США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибро-нектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки, которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с цитоскелетным белком-актином.

Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и соединенных на одном конце двумя S—S-мостиками. Размеры одной субъединицы 60—70x2—3 нм; на эту длину приходится от 2145 до 2445 остатков аминокислот. Каждый домен отвечает за одну функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином, другой домен — за прикрепление к пластику и т. д.

Доказано, что фибронектин имеется у всех представителей царства Ammalia. Амфотерный гликопротеин-фибронектин в изолированном виде выраженно стимулирует адгезию, если добавлять его к питательной среде в концентрации порядка 1—5 мкг/мл. Амфолит в данном случае выступает мостиком между отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и субстратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Свободная энергия поверхности твердого носителя может быть высокой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов) или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понятно, что при соответствующих обработках низкоэнергетические поверхности трансформируются в высокоэнергетические.

В качестве связующих мостиков можно применять ионы кальция или магния.

Наряду с плотностью заряда в прикрепляемости клеток большое значение имеют характеристики субстрата: гидрофильность его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонтальность. Распластываемость клеток на подложке будет выше, если число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади 10 нм². Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с искривленной поверхностью хуже гладких — растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата (здесь существен вклад цитоскелета, см.). Если, например, прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену — в 8 раз, к полипропилену — в 9 раз, к резине — в 12 раз, к алюминию — в 15 раз, к стеклу — в 16 раз, а к стали и полистирену — в 20 раз.

Крупномасштабное культивирование животных клеток в монослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы.

Выбранные клетки выращивают в строго, асептичных условиях в специальном оборудовании при медленном вращении роллерной системы или покачивании для смывания большей площади культуральной среды. Клетки то погружаются в жидкую фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их дыхательные потребности в кислороде.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры. Одни из них относятся к числу константных, другие — к числу вариабельных. Константными являются качество материала, форма и объем культиватора, вариабельными — скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО₂ в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания. Первые три вариабельных показателя можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд константных.

Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и производственных условиях. Сыворотки обеспечивали клетки необходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гормоны, простагландины и др.), ростовыми факторами (эпйдермаль-ным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленек-ротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин, ламинин), белками (альбумин, трансферрин, фетуин), микроэлементами и липидами, для выживания in vitro. Обычно используют фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отличаются сыворотки, рекомендуемые фирмой Sigma (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного, лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови.

Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру — в пределах + 36—+ 37,5°С. Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем [(СО₂—NaHCO₃), трис- и др.], а температуру — с помощью терморегуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).

Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах.Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в •питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители-с клетками моделируют глубинные культуры, например, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток.

Подход к выбору сред и контролируемого параметра культивирования остается прежним. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе — в градиенте плотности), фильтрованием, или, чаще, обработкой трипсином с последующими промыванием и сепарированием.

Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура).

Клеткам животных в глубинных культурах почти во всех случаях требуется защитная матрица, функцию которой берут на себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирования. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость животных клеток по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов с использованием животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих случаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, непрерывными или полунепрерывными.

49..Антибиотики как биотехнологические продукты. Биологическая роль антибиотиков как вторичных метаболитов. Пути создания высокоактивных продуктов антибиотиков.

В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты. Открытие антибиотиков произвело переворот в лечении инфекционных заболеваний. Ушли в прошлое представления о неизлечимости многих бактериальных инфекций (туберкулез, сепсис, сифилис и др.). Антибиотики применяют в ряде отраслей народного хозяйства (растениеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышленность и др.), где они используются более широко, чем в медицине. Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотехнологии.

К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики, продуцируемые растительными объектами, называют фитонцидами. Вопрос о физиологических функциях антибиотиков, их месте в метаболизме и процессах эволюции окончательно не решен. Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов, поэтому многие из них служат средствами нападения и защиты, т. е. представляют собой своеобразное химическое «оружие» клетки. Однако эти функции у антибиотиков не единственны. Известно, что они могут участвовать в процессах детоксикации вредных метаболитов, контролировать некоторые стороны обмена веществ и целые процессы развития, например дифференцировку клеток, служить запасными питательными веществами. Некоторые исследователи рассматривают антибиотики как случайные вещества, обладающие полезными свойствами, другие считают их реликтовыми молекулами, вытесненными в ходе эволюции продуктами рибосомального синтеза, но и до сих пор сохранившими способность вмешиваться в биохимические процессы.

Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ.

50.Биомедицинские технологии. Определение. Характеристика.

Биомедицинские технологии – это технологические процессы с использованием биотехнологических систем – живых организмов и компонентов живой клетки. Системы могут быть разными – от микробов и бактерий до ферментов и генов. Биомедицинская технология – это производство, основанное на достижениях современной науки: генетической инженерии, физико-химии ферментов, молекулярной диагностики и молекулярной биологии, селекционной генетики, микробиологии, биохимии, химии антибиотиков.

В сфере производства лекарственных средств она вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнологическим способом способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы.

В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в медицине – разработка медицинских биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического дейстрия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались.

На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США, пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12—14% в год и к 2007 г. составит примерно 20 млрд. долларов.

Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» — чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.

51.Препараты биогенных стимуляторов. Характеристика. Классификация. Технологические схемы производств.

Биогенные стимуляторы, будучи введены в «большой» организм (путем пересадок консервированных тканей или инъекций экстрактов), активизируют в нем жизненные процессы. Усиливая обмен веществ, они повышают физиологические функции организма, в случае болезни – повышают его сопротивляемость и регенеративные свойства, способствуют выздоровлению.

Химическая природа биогенных стимуляторов до настоящего времени до конца не изучена. Установлено, что при биостимуляции происходит глубокие биохимические изменения.

Процессы образования и накопления биогенных стимуляторов в тканях в результате понижения температуры тщательно изучены А. В. Благовещенским. Автор считает, что при этом нарушаются окислительные и гидролитические процессы, происходит накопление сложной смеси аминокислот и продуктов их дезаминирования. Благодаря окислительному дезаминированию в процессе консервирования тканей из аспарагиновой кислоты образуются яблочная, фумаровая и янтарная кислоты; из фенилаланина — коричная; из тирозина — параоксикумаровая и ряд других кислот. Указанные вещества в случае восстановления нормальных условий для жизнедеятельности клеток или при выделении в другой организм могут соединяться с инертными белками и способствовать их активации. Возможно, что дикарбоновые кислоты, входящие в состав биогенных стимуляторов, соединяясь своими карбоксильными группами со свободными аминными группами белковой молекулы, вызывают в последней деформацию в силовых полях, связанную с образованием новых энергетических уровней. Тем самым повышается способность ферментов к трансформации энергии. Повышение качества ферментов, считает А. В. Благовещенский, как бы омолаживает весь организм. Накопление органических кислот (ацидоз тканей) яблочной, янтарной может образовываться вследствие дезаминирования аспарагиновой кислоты. Превращение яблочной кислоты, благодаря ее дегидрированию и восстановлению фумаровой кислоты, приводит к накоплению янтарной кислоты. Непредельные кислоты ароматического ряда — коричная и оксикоричная — могут образовываться из тирозина и фенилаланина в результате гидролиза гликозидов, содержащих эти кислоты.

В консервированных на холоду листьях алоэ А. Ф. Сысоевым также обнаружены разнообразные органические кислоты: лимонная, яблочная, янтарная, рибонуклеиновая, аргинин. Эти кислоты и их натриевые и калиевые соли в определенных концентрациях оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дегидразную активность гранулирующих тканей и регенерирующей печени.

Количество лимонной кислоты в очитках некоторых растений увеличивается более чем в два раза в процессе биостимуляции. Биологическая активность натриевой и калиевой солей лимонной яблочной и янтарной кислот определенных концентраций оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дигидразную активность гранулирующих тканей регенерирующей печени.

Имеющиеся к настоящему времени сведения о химическом свойстве препаратов (по В. П. Филатову) показывают, что различные по своему происхождению вещества могут являться общими компонентами для всех препаратов этой группы — органические кислоты, полисахариды; вместе с тем есть и сугубо индивидуальные вещества. Так, летучие амины обнаруживаются в торфе и пелоидодистилляте в отличие от препаратов алоэ, а стероидные гормоны находятся лишь в препаратах плаценты.

Обобщение результатов целого ряда работ, посвященных выяснению химического состава, дает возможность сделать некоторые выводы. Биогенные стимуляторы не являются одним каким-либо специфическим веществом, образующимся при биостимулировании тканей. По мнению ряда исследователей, одна из основных ролей в биологической активности консервированных тканей принадлежит органическим карбоновым кислотам, представленным в виде смеси кислот в их естественном соотношении. Соотношения органических кислот могут быть различными, в зависимости от специфики обмена веществ в той или иной ткани. В период стимулирования тканей, помимо карбоновых кислот, накапливаются продукты промежуточного обмена; весьма вероятно, что их присутствие может усиливать биологическую активность карбоновых кислот и таким образом дополнять комплекс активных веществ. Считается, что лечебный эффект тканевой терапии можно отнести за счет специфического действия присутствующих в тканевых препаратах рибонуклеиновой, травматиновой аминокислот, а также азотсодержащих веществ, углеводов, липидов.