Клонирование гибридомных клеток 3 страница

Появились первые сообщения о лечении человече-ских лимфом с помощью моноклональных антител против опухолевого антигена. В опытах in vitro удается избирательно уничтожить опухолевые клетки человека антителами, к которым присоединены ток-сины. В работе сообщили об излечении мышей АКК с перевивным Т-лейкозом моноклональными ан-тителами против не опухолевого, а дифференцировоч-ного антигена Тnу-1,1.

56.Ферменты, используемые в генетической инженерии. Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную плазмиду. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку.

Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа; 1) получение нужного гена; 2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены). Рассмотрим по отдельности каждый этап.

Получение генов.Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) воссозданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).

Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Помимо этого, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК- Большим успехом в применении метода, основанного на РНК-зависимом синтезе ДНК, является получение в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина),

Введение гена в вектор.Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы — это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы.

Различают два основных класса векторов: вирусы и плазми-ды. Важной проблемой, возникающей при использовании вирусов в качестве генетических векторов, является их аттеньюа-ция — ослабление патогенности для хозяина, чтобы зараженные вирусом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов открывает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом отношении открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем клеткам человеческого тела.

Плазмиды — автономные самореплицирующиеся генетические единицы, найдены у бактерий, грибов, растений и животных. Наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды Е. coii.

Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т. е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Перенос неконъюгативных плазмид путем конъюгации возможен только в том случае, если имеется плазми-да-помощник, способная к самостоятельному транспорту. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т. е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипиче-ского выражения генов.

При конструировании векторов исследователь вводит в него участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам можно отобрать клетки, являющиеся носителями вектора.

Большой интерес представляют космиды — плазмиды, в состав которых введен cos-участок ДНК фага К Е. со//, отвечающий за упаковку ДНК в фаговую частицу. Такие плазмиды способны передавать очень большой объем генетической информации (до 10 тыс. пар азотистых оснований), рекомбинантные ДНК могут быть упакованы в фаговые частицы.

Применительно к генетической инженерии растений перспективны плазмиды бактерий родов Rhizobium и Agrobacterium. Agrobacterium tumifaciens содержит так называемые Ti (tumor-inducing — опухолеродные)-плазмиды, Т-участок ДНК плазмид может встраиваться в геном растений некоторых видов. К числу таких видов растений принадлежат крестоцветные, а также представитель однодольных Asparagus officinalis, что открывает перспективы трансформации злаков с использованием Ti-плазмид (D. von Wettstein, 1984). Ti-плазмиды содержат три гена (онкогены), два из которых кодируют стадии синтеза ауксина, а третий отвечает за синтез цитокинина. Рост нормальных клеток растений регулируется поступлением этих гормонов извне. Клетки, содержащие Т-участок Ti-плазмиды в интегрированном состоянии, размножаются бесконтрольно, образуя наросты — злокачественные опухоли. Плазмиды могут быть «обезоружены» вырезанием у них онкогенов. Вставка в Т-участок гена, кодирующего желаемый продукт, ведет к превращению плазмид в полезный вектор для генетической инженерии. Ti-плазмиды индуцируют в зараженных клетках синтез аномальных аминокислот—производных аргинина: октопина и нопалина, называемых вместе опинами (В. И. Негрук, 1984). Способность к синтезу опинов является полезным генетическим маркером. Agr. rhizo-genes содержит Ri (root-inducing — индуцирующие образование корневых волосков)-плазмиды, которые в клетках растений тоже индуцируют синтез опинов. Как в Т1-, так и в Ri-плазмиды можно встроить длинные нуклеотидные последовательности, что позволяет транспортировать в клетки растений значительные количества генетической информации.

Перенос генов в клетки организма-реципиента.Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, наиболее распространенным способом передачи информации служит трансформация.

Трансформация — это перенос свободной ДНК, в том числе и плазмидной, в. реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходят рекомбинация и интегрирование однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента или какую-либо внехромосомную генетическую единицу. Трансформацию может вызывать ДНК бактерий; впервые это наблюдал Гриффит у пневмококков (1926).

Проникновение ДНК в клетку бактерии требует ее компетентного, т. е. восприимчивого, состояния. У представителей Streptococcus и Pneumococcus выделены и очищены факторы компетентности— белки с молекулярной массой 5—10 мД. Компетентность клетки определяется также условиями внешней среды. У Е. coli и В. subtilis эффективная трансформация достигается обработкой клеток СаСЬ и полиэтиленгликолем (ПЭГ).

Генетический материал, проникающий в клетку, может быть атакован внутриклеточными нуклеазами. В этой связи успешной трансформации способствует: 1) подавление активности или синтеза нуклеаз (трансформация клеток Е. coii с высокой эффективностью была проведена при использовании мутантов, дефектных но нуклеазам) и 2) включение трансформирующей ДНК в липосомы — искусственные мембранные липидные везикулы.

Для проведения трансформации растений и грибов, в частности дрожжей, необходимо получение интактных протопластов. При трансформации протопластов дрожжей с помощью химерных плазмид, сочетавших плазмиду ColEI E. coli и ген LEU2 дрожжей, в присутствии ПЭГ и СаС1₂ клетки приобретали способность синтезировать лейцин. Аналогичным способом получены дрожжи, устойчивые к антибиотику тетрациклину. Ti- и Ri-плазмиды Rhizobium и Agrobacterium трансплантируются в протопласты растительных клеток путем трансформации. Совместное культивирование протопластов растений (петунии) и Agro-bacterium tumifaciens ведет к необычайно высокоэффективной трансформации растительных клеток. Клетки растений могут быть трансформированы генетическим материалом вирусов при включении в фосфатидилсеринхолестериновые липосомы в присутствии ПЭГ и СаС1₂.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Конъюгацию и трансфек-цию можно рассматривать как варианты трансформации, осложненной наличием специальных приспособлений для эффективного переноса генов.

Путем конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). В этом случае информация перекочевывает из одной клетки бактерии (мужской, донорной) в другую клетку (женскую, реципиентную) по половым ворсинкам, представляющим собой белковые трубочки. Хотя круг плазмид, самостоятельно осуществляющих конъюгатнвный перенос, ограничен, неконъюга.тивные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид - помощников.

Под трансфекцией понимают передачу всего набора генов вируса или фага, приводящую к развитию вирусных частиц в клетке. В генетической инженерии методика проведения трансфекции включает в приложении к бактериям получение сферопластов, очистку среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК того или иного фага в сочетании с протаминсульфатом, значительно повышающим эффективность трансфекции. Для стабилизации сферопластов добавляют спермин и другие полиамины (3. Б. Шабарова и др., 1980). Транс-фекция клеток растений и животных соответствующими векторами вирусной природы может быть проведена как при использовании очищенной ДНК и протопластов, так и при заражении целых многоклеточных организмов (в этом случае чаще говорят не о трансфекции, а об инфекции) вирусными частицами или их ДНК. В последние годы сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.

57.Цикл развития каллусных клеток, понятие дифферинцировки и дедифференцировки в основе каллусогенеза. Тотипотентность и ее значение.

Основным типом культивируемой растительной клетки явля-ется каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухо-лей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток при поверхностном и глубинном выращивании мало отли-чаются внешне и на уровне морфологии клеток от культур кал-лусных клеток. Значительным физиологическим различием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяюoая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Опухолевые клетки лишены так-же способности дать начало нормально организованным струк-турам — корням или побегам в процессе органогенеза и эмбрио-идам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых слу-чаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные струк-туры), нормальное развитие которых дальше не происходит.

Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой гормононеза-висимости кодному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенети-ческой (результат экспрессии генов, определяющих гормононе-зависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпиге-нетической они теряют признак гормононезависимости в ряду превращений клетка-*-растение-*-клетка, что и является доказа-тельством негенетической природы такой приобретенной гормо-нонезависимости.

Каллусная клетка-,--в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточ-ной дифференцировки. Для растения каллус является тканью, возникающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей не-продолжителькое время. Эта ткань защищает место поражения, накапливаег питательные вещества для анатомической регене-рации или (и) регенерации утраченного органа.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду іп vitro в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддер-жание пересадочной культуры требует строго стерильных усло-вий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экс-планты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раство-ра стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрова-нием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 19,6 *10⁴ Па (2 атм) в течение I ч или сухим паром в шкафах при 160°С в течение 1,5 ч стерилизуют посуду, инстру-менты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облу-чаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воз-духа в рабочий объем (Р. Г. Бутенко, 1964).

Особенности дедифференцировки зависяі_от генетических характеристик тканей. Клетки тканей запасающеи паренхимы, корня и стеб-ля, мезофилла листа и других специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую мине-ральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении и вернуться к состоянию делящейся клетки.

При изучении молекулярных механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировке, т. е. с какой фазы ей предстоит двигаться повторно по циклу. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки — эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбня и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причик гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функционалыіые особенности ислодных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.

В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специали-зированных клеток, в самом начале культивирования могут на-блюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматиче-скими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к про-цессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомен-довать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в тече-ние 3—6 сут. Это позволяет исключить не только изменения, свя-занные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При соблюдении указанного условия становится ясной роль в индук-ции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цито-кининов, дедифференцировке специализированных клеток и в гюддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приво-дящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюда-ются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокинина-ми. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Со к вступлению в S-фазу клеточного цикла. Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к среде кинетина или другого цитокинина (табл. I).

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК (рис. 2), исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменени-ях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедиффе-ренцировке.

Очень своеобразно проходит процесс дедифференцировки и каллусогенеза в апикальной меристеме стебля (рис. 3). Сразу после помешения на пита-тельную среду меристемы стебля томатов наблюда лось прекращение мито-зов, свойственных ткани іп vivо клетки дедифференцнровались, увеличивались в объеме, терялн характерную для мери-стематической клетки фор-му, изменялась структура ядра и цитоплазмы и только после этого в них происходило деление, при-водящее к формированию каллусной ткани.

Образование каллуса не во_всехслучаях связ.а-но с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате гіролнферацйи внутреннЮГтканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не свя-занного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Гашюидная микроспора, проявившаяся в результате мейоза, при культивировании пыль-ника іп vitro отклоняется в ряде случаев от нормального про-цесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным де-лениям, а сама клетка дедифференцируется и преврашается в каллусную. Образование каллуса при эксплантировании фраг-мента ткани в условиях іп vitro свойственно двудольным и одно-дольным покрытосеменным и голосеменным растенйям, папорот-никам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы тка-ни на 30—40 мл питательной среды.

Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интакт-ного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят іп vitro к сложному про-цессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную орга-низацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.

В процессе субкультивирования формируется штамм, характе-ризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.

58. Характеристика каллусных и суспензионных культур тканей растений. Понятие физиологической асинхронности и физиологической гетерогенности.

Каллус — неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток.

Метод культур тканей, или микроразмножение in vitro исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят эксплант; сезона года. Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищен-ные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удале-нием покрывающих структур их каждый раз протирают 70% этанолом. Открытые органы — источники эксплантов подвергают стерилизации ртуть- или хлорсодержащими агентами.

Самая длительная стерилизация по времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно меньше. В усредненном варианте и применительно к различным культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70–95%), рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,01— 0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5; 5—30 и 5—20 минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом. После этого ткань тщательно промывают водопроводной водой в течение 10—30 минут, а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалты-вают в течение отведенного времени. После стерилизации расти-тельный биообъект трижды промывают свежими порциями стерильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими проце-дурами: проведением стерилизации под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того, как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов как твин 80 или твин 20 в виде добавок к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натя-жения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с .материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости (сосуды) для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в сравнении с агаризованной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяющихся в среду, а также предохранять клеточную линию от существенных повреждений при изучении метаболитов, продуцируемых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры могут поддерживаться в течение длительного времени без замены культуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культивирования растительных тканей должны производиться в соответствии с требованиями СМР. Этим гарантируется их высокое качество. Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах. В принципе желательна стерилизация автоклавированием (120⁰С) небольщих объемов питательных сред, поскольку многие ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагрева-нии и давлении. Установлено, что температура выше 120⁰С может быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,22 мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед их использованием. Питателъные среды по своему составу достаточно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны. В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы: источники органического углерода (чаще — сахароза), неоргани-ческие соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти универ-сальной средой для клеток различных видов является среда М5 Т. Мурасиге и Ф. Скуга (см. главу 4). Тем не менее, при работе с разными растительными объектами необходим специальный под-бор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Пи-тательные среды могут быть плотными за счет внесения 0,7—1% агар-агара ижидкими. Показано,например,чтодлямикрокультуры ананасов предпочтителънее жидкие среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из существующих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги, равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они формируются непосредственно в родительской ткани; из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

59. Синтез вторичных метаболитов с использованием культуры клеток и тканей растений.

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые илитяарлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию воробейника (Lithospermum erythrorbizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем. За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм.

62.70.Иммунобиотехнология. Диагностикумы, аллергены, бактериофаги, токсины и анотоксины. Характеристика и способы получения.

Иммунобиотехнология — это раздел современной биотехнологии, представленной как научными достижениями, так и динамично развивающимся технологическим производством диагностических, профилактических и лекарственных средств с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной системы. Известно, что человек обладает иммунной системой для защиты от воздействия внешних неблагоприятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединенные под общим названием антигенов. Понятие «антиген» является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела.

В современной фармацевтической биотехнологии кроме иммуномодуляторов и иммуносупрессоров значительное место отводится лекарственным и диагностическим препаратам, получаемым на основе медиаторов иммунной системы.

Для организации масштабного производства моноклональных антител ключевую роль сыграл метод гибридомной технологии. Хорошо известно, что в результате иммунного ответа на какойлибо антиген образуется высокогетерогенный продукт — антисыворотка со смесью антител, продуцируемых разными линиями Влимфоцитов и направленных к разным антигенным детерминантам антигена. Проблема получения определенной линии лимфоцитов, которые не растут на искусственной среде in vitro в культуре, была решена, как только стало возможным получение соматических гибридов. Известно, что миеломы (злокачественные опухоли костного мозга, клетки которых обладают способностью к неограниченному росту) продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов.

В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн сумели впервые выделить клоны клеток, способные секретировать только один тип молекул антител и в то же время расти в культуре. Эти клоны клеток были получены слиянием антителообразующих и опухолевых клеток — клетокхимер, названных гибридомами, так как, с одной стороны, они наследовали способность к практически неограниченному росту в культуре, а с другой стороны, способность к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).

Весьма существенно для биотехнолога то, что отобранные клоны могут длительно храниться в замороженном состоянии, поэтому в случае необходимости можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получатъ из культуральной жидкости.