Приготовление сред для культивирования.

Подготовка миеломных клеток. Необходимо учесть, что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слиянию падает или же синтез антител гибридными линиями становится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наилучшие результаты, заморозить в достаточном количестве. Успех в получении гибридом в значительной мере определяется правильной подготовкой миеломных клеток.

Клетки питающего слоя. Техника получения гибридом в сущности представляет собой выращивание клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности. Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. В связи с этим при получении гибридом часто используют клетки питающего слоя (feeder cells), которые снабжают культуру различными жизненно необходимыми факторами. Этот эффект будет проявляться тем сильнее, чем менее оптимальной является среда культивирования. При использовании некоторых партий сывороток и сильно обогащенных сред эффект клеток питающего слоя может и не выявляться.

В качестве клеток питающего слоя используют клетки селезенки, тимоциты, перитонеальные макрофаги, мышиные фибро-бласты и др. В. Лонг и сотрудники (1986) получили очень хорошие результаты при использовании облученных диплоидных фиб-робластов легкого человека (линии IMR-90. MRC-5, WI-38).

Кондиционированные среды.Использование клеток питающего слоя имеет ряд недостатков: 1) их приготовление трудоемко и накладывает определенные ограничения по времени на приготовление гибридом; 2) они представляют собой потенциальный источник бактериального загрязнения; 3) они метаболизируют питательную среду, что создает необходимость часто менять ее; 4) растущие клетки в питающем слое могут перерастать или убивать гибридомы; 5) клетки питающего слоя препятствуют визуальной идентификации растущих колоний гибридом.

Всех этих недостатков лишены кондиционированные среды, представляющие собой супернатанты культур, в которых росли клетки питательного слоя. Кондиционированные среды в культивировании клеток используются давно в качестве средства замены клеток питающего слоя. Для получения гибридом использовались среды, кондиционированные эпителием человека, клетками эндотелия, перитонеальными макрофагами и мышинными фибробластами.

Приготовление суспензии клеток селезенки.Все процедуры выполняют при комнатной температуре.

Слияние

Существует два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метод заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГ при 37°С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования.

Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30—35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5—7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, отмывают и культивируют.

Как отмечалось выше, вместо клеток питающего слоя можно использовать кондиционированную среду. Среду, кондиционированную перитонеальными макрофагами, добавляют к среде культивирования в соотношении 1:1.