Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения гибридом включает в себя следующие этапы: иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток. Обычно вся процедура занимает 3—4 мес.

Приготовление отдельных компонент сред для культивирования.Одной из частых причин неудач при получении гибридом является недостаточно высокое качество сред и реактивов. Поэтому крайне важно перед началом работы обеспечить постоянное снабжение высококачественными реактивами и средами.

Основными средами, употребляемыми при получении гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности среда Дульбекко в модификации Искова (эта среда особенно часто используется при иммунизации m vitro). Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

Выбор экспериментального животного.Он определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридов клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей берут линию Balb/C; это связана с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образующие гибридомы, получены от этих мышей. Однако сила иммунного ответа у различных линий мышей может отличаться, и бывают ситуации, когда необходимо иммунизировать мышей другой линии. В этом случае полученные гибридомы выращивают на гибридах FI этой линии и линии Balb/C.

Иммунизация крыс проводится в тех случаях, когда требуется получить антитела к антигенам мыши, для которых отсутствует полиморфизм у разных линий мышей. Полученные гибридомные клетки можно выращивать в организме крыс, если применять миеломные клетки крыс, или в организме мышей после подавления их иммунологической реактивности (см. ниже).

Иммунизация.Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Как отмечалось выше, до сих пор неизвестно, какие именно клетки способны гибридизироваться с образованием антителообразую-щих гибридом. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделять селезеночные клетки животных через 3—4 сут после последнего введения антигена, т. е. тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков — слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитироваиного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект — отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

Приготовление сред для культивирования и получение клеточных суспензий