Генетическая инженерия

Термин генетическая инженерия появился на рубеже 70-х годов XX века. Тогда же впервые был выделен in vitro «чистый» ген (лактозный оперон кишечной палочки) и химическим путем был синтезирован ген аланиновой тРНК дрожжей.

Эмбриологи к тому времени достигли значительных успехов в манипулировании зародышевыми клетками животных. У лягушки из яйцеклетки они удаляли ядро и вводили ядро кишечной стенки головастика. В результате получали нормальную взрослую особь. Так впервые неполовым путем был воспроизведен организм животного. Это достижение дало возможность клонировать особи, т. е. получать их генетически идентичные копии, а также заменять определенные дефектные гены полноценными, т. е. осуществлять генную терапию. Именно для этого процесса первоначально был введен термин «генетическая инженерия». Однако вскоре стало ясно, что с появлением «чистых» генов открывается перспектива конструирования бактерий с несвойственными им признаками, в том числе и высокоэффективных штаммов промышленных организмов. Поэтому генетической инженерией стали называть комплекс молекулярно-генетических методов, с помощью которых можно осуществлять целенаправленное конструирование организмов путем различных операций над информационными молекулами (В. Н. Рыбчин, 1999).

Генетическая инженерия состоит из двух разделов: генной и геномной инженерии (табл. 9.2).

Генная инженерия методами т vivo или in vitro решает задачи введения в геном реципиентной клетки одного или нескольких чужеродных генов либо создания в геноме новых типов регуляторных связей. В таких случаях видовая принадлежность реципиентных организмов не меняется, но появляются не свойственные им признаки.

Геномная инженерия осуществляет более глубокое вмешательство в геном, вплоть до создания новых организмов. Методы решения таких задач различны для вирусов и для про- и эукариотических клеток.

Особые успехи генетической инженерии связаны с так называемой векторной трансформацией. В основе этого подхода лежит использование векторных молекул, или векторов, в качестве которых применяли плазмиды. Векторы — это молекулы ДНК, способные переносить включенные в них гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Плазмиды — это внехромосомные факторы наследственности, генетические элементы, способные стабильно существовать в клетке в автономном, не связанном с хромосомами состоянии. Термин «плазмиды» был предложен Дж. Ледербергом и др. в 1952 году. Плазмиду, способную объединяться с хромосомой, называют эписомой. К плазмидам относят генетический аппарат клеточных органоидов (митохондрий, пластид), а также группы сцепления генов, не являющиеся жизненно важными для содержащих их клеток. Из последних наиболее изучены бактериальные плазмиды — фактор фертильности (F-фактор), колнциногенные (колицины-антибиотики) факторы (Col-факторы), факторы устойчивости к лекарственным веществам (R-фактор), профаги и др.

многие плазмиды представляют собой кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК. Они широко распространены в живых клетках (в том числе И высших организмов) и интенсивно используются в генной инженерии качестве основных компонентов разнообразных молекулярных переносчиком чужеродной ДНК.

В качестве векторов сначала применяли плазмиды бактериальных, а затем и Эукариотических клеток. Практическое использование векторов в селекции растений относится к последним десятилетиям и связано с Ti-плазмидой Agrobacterium tumefaciens. Агробактериум тумефациенс — это почвенная бактерия, которая вызывает опухолевое заболевание растений (корончатый галл), известное еще Аристотелю. В начале XX века (1907) , Е. СМИТ И К. Таундсен выделили чистую культуру A. tumefaciens и устано-

вили, что она способна вызывать опухоль у некоторых представителей голосеменных и у большинства двудомных покрытосеменных растений. Клетки растительных опухолей интенсивно растут на искусственных средах и при этом не нуждаются в добавлении фитогормонов, в отличие от клеток нормальных тканей (С. Г. Инге-Вечтомов,1989).

В 70-е годы выяснилось, что причиной опухолеобразования являются Ti-плазмиды (7; — tumor inducing, англ. — индуцирующая опухоль). Они были обнаружены в клетках некоторых штаммов A. twnefaciens. Ti-плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК размером 50—80 мкм, молекулярной массой около 1,3 х 108 Дальтон и длиной от 140 до 250 тыс. пар нуклеотидов. Плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК 7г-плазмиды, так называемая Т-ДНК, вызывает:

1) образование опухоли;

2) гиперпродукцию фитогормонов — цитокининов и ауксинов (индоли-луксусная кислота);

3) синтез ряда производных аминокислот, объединяемых под общим названием опины.

Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источника углерода и азота, причем только в том случае, когда A. twnefaciens. содержит Ti-плазмиду, заразившую клетки растения (рис. 9.3).

Описанный здесь процесс взаимоотношений A. twnefaciens и высших растений Дж. Шелл назвал «генетической колонизацией», которая представляет собой природный эксперимент по генной инженерии.

В настоящее время выделены и проклонированы несколько десятков генов высших растений, в том числе гены, контролирующие запасные белки сои, ячменя, гороха, кукурузы, а также некоторые гены, контролирующие активность ферментов. На базе 27-плазмид были созданы векторы, способные интегрироваться в растительные хромосомы. Это дало возможность вводить в клетки растений чужеродные гены и получать из одной-единственной клетки сформировавшееся растение. Организмы, в которых чужеродные гены обнаруживаются во всех клетках, включая половые, называются трансгенными. Они обладают свойством передавать приданные им новые признаки своему потомству.

Первыми чужеродными генами, введенными в начале 80-х годов в высшие растения, были гены устойчивости к антибиотикам из Е. coli. В клетки подсолнечника с помощью 7г-пдазмид был передан ген фазеолина бобов. Фазеолин — это гликопротеин, составляющий до 50,% запасного белка бобов. Будущее растение названо санбин [санбин = sunflower (подсолнечник) + bean (бобы)]. Получены растения табака, которые светятся в темноте благодаря экспрессии в них гена люциферазы светлячка. В Цен-

тральном НИИ лесной генетики и селекции (г. Воронеж) в конце 80-х годов были начаты первые опыты по генетической инженерии с лесными древесными растениями. Однако в последние годы эти исследования, к сожалению, прекращены.

В целом же получение трансгенных растений идет по нарастающей. Они уже вышли за пределы лабораторий. В 1994 году впервые на рынке появились томаты, которые остаются твердыми многие недели после их сбора. Прошли полевые испытания устойчивые к гербицидам табак, хлопок, картофель, томаты, кукуруза, свекла, рапс, салат-латук и др. Однако остаются вопросы их экологической устойчивости и влияния на окружающую среду, а в некоторых случаях и на их потребителей. Эти проблемы время от времени ставятся в повестку дня и разрабатываются специальные мероприятия по изучению и предотвращению возможных вредных последствий выведения использования 'трансгенных растений.

Одним из продуктивных направлений генетической инженерии применительно к растениям стала клеточная инженерия растений. Она основана на тотипотентности клеток, что означает сохранение их способности к делению и передифференцировке даже в зрелом состоянии. Эта способность проявляется при культивировании растительной ткани в среде, содержащей необходимые питательные вещества и факторы роста (фитогор-моны — ауксины и цитокинины). Клетки ткани дедифференцируются и начинают делиться, образуя однородную массу, так называемый каллус. Внутри каллуса формируются побеги, затем корни. Если концентрация ауксинов в среде существенно больше, чем цитокининов, то формируются только корни. Если соотношение концентраций обратное, образуются только побеги. Культивировать можно не только ткани, но и отдельные клетки и даже изолированные протопласты. Схема регенерации растений из изолированных клеток или протопластов показана на рис. 9.4.

Разработка и применение способов получения и слияния протопластов растительных клеток, а также регенерация у них клеточной стенки в сочетании с методами культивирования и дифференцировки клеток in vitro позволили конструировать рекомбинанты, минуя половой процесс, т. е. создавать соматические гибриды. Это также позволяет объединять протопласты отдаленных видов растений, между которыми половая гибридизация невозможна.

Первые успехи в получении соматических гибридов растений данным методом были достигнуты в середине 60-х годов XX века. Вначале были выделены межвидовые гибриды (табака, моркови, петунии и дурмана), затем удалось получить и межродовые соматические гибриды (картофель х х томат, дурман х белладонна). Дальнейшие исследования в направлении соматической гибридизации и повышения стабильности выведенных организмов обещают значительный экономический эффект.

но и других организмов, полученных с помощью методов этой науки. Очевидно, эти опасения небезосновательны, как очевидно и то, что, однажды появившись, эти методы уже не исчезнут и будут только развиваться и совершенствоваться. Поэтому ничего не остается делать как принимать какие-то меры, и в первую очередь законодательного порядка, чтобы предупредить возможные негативные последствия деятельности такой молодой, такой многообещающей и в то же время небезопасной науки, как генетическая инженерия.

Вопросы для самопроверки

1. Что такое мутации? Назовите принципы их классификации.

2.Дайте определение генных или точковых мутаций? Какие группы этих мутаций Вы можете назвать?

3.Как классифицируются хромосомные мутации? Охарактеризуйте отдельные классы.

4.Что такое мутации геномов, полиплоидия и анеуплаидия? Приведите классификацию полиплоидов и анеупаоидов.

5.Приведите примеры полиплоидов и анеугыоидов среди древесных растений.

6.Назовите разделы генетической инженерии.

7.Что такое векторы и плазмиды?

S. Какие растения называются трансгенными? Приведите примеры. А

9. На чем основана клеточная инженерия растений и каковы ее возможности?

Масштабы работ по генетической инженерии к настоящему времени приобрели такой размах, что это вызывает обеспокоенность экологических и некоторых политических организаций в отношении возможных негативным последствий со стороны не только собственно трансгенных растений.

Глава 10