ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В СОВРЕМЕННОЙ МЕДИЦИНЕ

Для современной медицины характерно быстрое восприятие самых разнообразных методологий всего комплекса наук о живом. Поэтому неудивительно, что сравнительно недавно появившиеся методы генетической инженерии стали активно использоваться медициной, в результате чего открылись принципиально новые возможности профилактики, диагностики и лечения целого ряда заболеваний. В настоящем обзоре сделана попытка кратко осветить основные достижения практической медицины, полученные с использованием методов генетической инженерии. Генетическая инженерия — это совокупность методов, позволяющих получать in vitro самовоспроизводящиеся в клетках молекулы ДНК с заранее заданной структурой. С помощью таких методов любые фрагменты ДНК могут быть введены в состав так называемых векторных молекул ДНК (молекул, которые применяются для размножения необходимой молекулярной структуры). В качестве векторов чаще всего используют плазмиды (кольцевые автономно реплицирующиеся внехромосомные двуспиральные ДНК) и бактериофаги. Таким образом получают гибридные молекулы (т.е. нуклеиновые кислоты синтезируют путем гибридизации — слияния разных фрагментов молекул), которые могут быть размножены в бактериальной клетке. Клетки или фаги, несущие потомство одной гибридной (рекомбинантной) молекулы ДНК, называют клоном, а сам процесс получения клонов — клонированием. Источниками ДНК для клонирования служат фрагменты геномной ДНК, ДНК — копии информационных РНК и химически синтезированные ДНК. Если к фрагменту ДНК, кодирующему какой-либо белок, присоединить необходимые регуляторные элементы и ввести такую мо­лекулу в клетку в составе векторной ДНК, то клетка наряду со «своими белками» будет синтезировать и новый белок, структура которого закодирована во введенной ДНК. В этом случае говорят, что введенная генетическая информация экспрессируется в клетке.

Несмотря на то, что еще далеко не все ясно в самом процессе реализации генетической информации, сегодня получение многих белков с помощью генно-инженерных продуцентов — это уже вопрос технологии. К 1986 г. в медицинскую практику ряда стран вошли препараты инсулина, гормона роста и интерферона, получаемые с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Должно быть, список генно-инженерных препаратов значительно расширится в ближайшие годы. На данном этапе зарубежными фирмами налажен выпуск многих пригодных для использования в медицине белковых продуктов, получаемых с помощью генно-инженерных продуцентов (см. таблицу).

Перечень веществ белковой природы, потенциально пригодных в медицине, постоянно пополняется. Так, несомненно, найдут широкое применение факторы роста — эпидермальный, фибробластов, тромбоцитов, трансформирующие. По всей видимости, их можно будет применять для лечения ран, язв, ускорения сращивания костей, в качестве ангиогенных, антивоспалительных и, вероятно, противораковых средств. С помощью факторов, стимули­рующих рост колоний и интерлейкина-3, по-видимому, окажется возможным увели­чивать количество форменных элементов крови избирательным образом, что бывает необходимо при потерях крови, лучевой болезни, интоксикациях и инфекциях. Гемопоэтин и эритропоэтин могут найти применение при поте­рях крови и анемиях. Ангиогенин, стимулирующий рост сосудов, может быть использован при лечении болезней печени, при ожогах и ранениях. Проводятся испытания соматостатина, оказывающего эффективное действие при желудочных кровотечениях. Пептид, связанный с геном кальцитонина, на сегодняшний день самое мощное сосудорасширяющее средство. Недавно была проклонирована кДНК Мюллеровской ингибирующей субстанции — белка, потенциально пригодного для рассасывания опухолей яичника.

Большие надежды возлагаются фирмой «Biogen» на антивоспалительное действие липокортина — белка, естественно возникающего в организме в ответ на воспаление. Список подобных белков можно значительно расширить. Ведутся работы по получению вакцин против вирусных и бактериальных заболеваний на основе генно-инженерных продуцентов. Уже стала коммерчески доступна вакцина против вирусного гепатита В, полученная на основе экспрессируемого в дрожжах гена поверхностного антигена гепатита В.

Многообещающе и использование вируса осповакцины в качестве вектора для клонирования и экспрессии генов чужеродных антигенных детерминант. Фрагмент ДНК, кодирующий поверхностный антиген патогенного микроорганизма, может быть введен в геном вируса путем рекомбинации in vivo с заранее сконструированной плазмидой. Полученный рекомбинантный вирус осповакцины будет экспрессировать введенный антиген при инфекции, в инфицированном организме бу­дут вырабатываться антитела на новый антиген. Более чем двухсотлетняя история вакцинации вирусом осповакцины показала его безвредность для человеческого организма. На основе рекомбинантных вирусов осповакцины будут, очевидно, созданы дешевые и эффективные живые вакцины против целого ряда инфекционных заболеваний. Уже сейчас созданы вирусы осповакцины, экспрессирующие антигены вируса везикулярного стоматита Ин­диана. вируса Симдбис, бешенства, гриппа, гепатита В, герпеса, вируса Эпстайна — Барра. НТLV-III.

Белковая инженерия, или белковый дизайн, — новое направление генетической инженерии где с помощью технологии рекомбинантных ДНК изменяют структуру белков, получают белки с новыми свойствами. Действительно, основные методы генетической инженерии позволяют оперировать со струк­турной частью гена — удалять фрагменты ДНК, заменять их другими, вводить новые. В результате экспрессии таких реор­ганизованных генов будут образовываться белки с удаленными, замененными, введенными вновь фрагментами аминокислотной цепи. Более тонкий метод белковой инженерии — введение точковых мутаций в кодирующую часть гена для получения новой аминокислотной последовательности в молекуле белка (точковая мутация—это удаление или замена нуклеотида в нуклеиновой кислоте).

Хотя метод появился сравнительно недавно, он уже применен в медицине. Так, заменой цистеина на серин была увеличена стабильность и удельная активность генно-инженерного препарата интерферона, замена метионина в положении 358 на аргинин в молекуле а-антитрипсина позволила создать и­гибитор аргинин-специфичных протеаз (Shapiro M. Et al., 1986). Мутантный анти-трипсин, видимо, найдет применение при лечении болезней, сопровождающихся нерегулируемой активацией калликреина и фактора VIII.

Белковая инженерия заслуживает самого пристального внимания как основа соз­дания принципиально новых препаратов белковой природы в ближайшем будущем.

К числу перспективных направлений применения генетической инженерии в медицинской практике относится диагностика наследственных и инфекционных заболеваний с использованием метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Суть метода заключается в следующем. В определённых условиях одноцепочные фрагменты ДНК или РНК образуют водородные связи (гибридизуются) с комплементарными одноцепочечными фрагментами ДНК или РНК. Стабильность двухцепочечного комплекса (гибрида) зависит от степени комплементарности между двумя цепями нуклеиновой кислоты. Условия гибридизации можно подобрать таким образом, чтобы образовывались только стабильные гибриды нуклеиновых кислот с высокой степенью комплементарности цепей. Используя реакцию гибридизации, можно выявлять (детектировать) наличие или отсутствие искомого гена в клинических образцах, а также изучать структуру определенных генов. В качестве зонда (одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты, применяемого в качестве реагента для идентификации искомой нуклеотидной последовательности) используют выделенные из генома или искусственно синтезированные фрагменты анализируемого гена. Обычно при гибридизации зонд находится в растворе, а тестируемая нуклеиновая кислота связана с твердой подложкой. Для гибридизации применяются зон­ды, содержащие радиоактивную или какую-либо другую метку. После завершения стадии гибридизации избыток несвязавшегося зонда удаляют путём отмывки, а образовавшиеся гибриды детектируют по наличию в них метки.

Для введения метки в зонды используется ряд методов. До недавнего времени в этих целях применялись, как правило, радиоактивные изотопы 32Р и 35S. Методы получения радиоактивно меченных зондов подробно описаны J. Meinkoth и соавт. Зонды для гибридизации, несущие меченые изотопы, интенсивно используются в лабораторных исследованиях. Однако, короткое время полураспада используемых изотопов, необходимость соблюдения определенных правил и условий работы, реализация которых в клинических лабораториях обычно затруднена, сдерживают широкое внедрение методов гибридизационной диагностики в клиническую практику. В связи с этим, а в последние годы еще шире развиваются подходы, предусматривающие применение нерадиоактивных зондов по чувствительности не уступающих радиоактивно меченным.

Одной из перспективных областей применения метода молекулярной гибридиза­ции в медицине является диагностика вирусных и бактериальных инфекций. С помощью этой техники можно детектировать патогенные организмы в различных биологических средах (кровь, моча, кал, ткани, орофарингеальные секреты), а также в образцах пищи. Большинство этих методов представляют собой варианты «дот» гибридизации, при которой образец после соответствующей обработки наносится на нитроцеллюлозный фильтр или другой носитель в виде пятна. Фильтр прогревают в вакууме, при этом нуклеиновая кислота необратимо связывается с носителем. После такой обработки проводят гибридизацию с меченым зондом. Обычно вся процедура, начиная с нанесения образцов, занимает около двух суток.

Гибридизационная диагностика была успешно использована для детектирования большого количества различных вирусных и бактериальных патогенов, таких, как вирус гепатита B, цитомегаловирус, вирус Эпстайна — Барра, энтеротоксикогенные штаммы Е. соli и сальмонеллы, а также многих других. В настоящее время чувствительность метода при использовании зондов с максимальной удельной активностью позво­ляет тестировать нуклеиновую кислоту анализируемого патогена в количествах до 10^-19 моль.

С помощью гибридизационного анализа можно проводить детектирование как отдельных штаммов, так и групп родственных вирусов или микроорганизмов. Для этого нужно использовать в качестве зондов или участки генома, специфичные для данного штамма, или консервативные участки, несущие последовательности, гомологичные у разных объектов. Благодаря высокой специфичности и относительной быстроте выполнения анализа метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот все более широко применяется для диагностики инфекционных заболеваний.

Гибридизационная диагностика используется также с целью выявления генетических аномалий, приводящих к функциональным нарушением в организме. ДНК для анализа можно выделять из лимфоци­тов крови, амниотической жидкости или биоптатов ворсинок хориона. Выделенную из образцов ДНК гидролизуют рестриктазами — ферментами, расщепляющими ДНК в участках с определенными последовательностями нуклеотидов длиной 4—6 пар оснований. В тех случаях, когда в анализируемом дефектном гене имеются делеции (разрывы) или вставки (дополнительные, не свойственные данному гену нуклеотидные последовательности), в процессе рестрикционного гидролиза образуются фрагменты ДНК, отличающиеся по длине от фрагментов, характерных для нормального гена. Аналогичный результат получается, если в анализируемом гене имеются точечные мутации в участках, «узнаваемых» рестриктазами.

При рестрикционном гидролизе образуется большой набор фрагментов ДНК, которые разделяют по длине с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем ДНК из геля переносят на лист нитроцеллюлозного или нейлонового фильтра и проводят гибридизацию с меченым зондом, несущим участок анализируемого гена или соседнего с ним района. После радиоавтографии на рентгеновской пленке проявляются только полосы, соответствующие фрагментам ДНК, относящимся к тестируемому гену. Сравнивая наборы полос, полученные в ходе анализа ДНК из клеток с нормальным и дефектным геном, можно выявлять наследственные патологии, связанные с нарушением структуры определённых генов. Если дефект гена не позволяет выявить различия описанным выше способом, в качестве генетического маркера можно использовать полиморфизм ДНК, фланкирующей изучаемый локус.

Для одного анализа обычно требуется 5-10 мкг суммарной ДНК. Необходимые количества можно выделить из нескольких миллилитров крови или амниотической жидкости. Анализы с использованием такого гормона и амниотической жидкости можно проводить с образцами, полученными в первом триместре беременности. Что несёт существенное значение для пренатальной диагностики наследственных заболеваний.

Если дефектный ген содержит точечную мутацию в участке «не узнаваемом» ни одной из известных рестриктаз, используют гибридизацию с меченым коротким фрагментом ДНК комплементарным анализируемому участку нормальной ДНК. Подбор соответствующихусловий гибридизации дает возможность селектировать образцы, содержащие мутантные ДНК поскольку прочность не полностью комплементарных гибридов ДНК-олигонуклеотидов заметно ниже. Таким способом удалось выявить точечные мутации в ДНК пациентов, больныхталассемием.

Помимо диагностики наследственных заболеваний описанные выше подходы были успешно применены при трансплантации спинного мозга, когда требовалась информация о генотипе по полиморфным локусам, кодирующим полипептиды HLA классов I и II. Специфические зонды к У-хромосоме позволяют определять пол плода, что бывает необходимо выяснять в случаях, когда имеется риск врожденных заболеваний, передаваемых по наследству в зависимости половой принадлежности плода.

Внедрение методов молекулярной гибридизации в медицинскую диагностику находится только на начальной стадии. С их усовершенствованием - переходом к использованию радиоактивных зондов спектр применения этих методов будет интенсивно расширяться.

Следует сказать о таком важном направлении генетической инженерии, как генная терапия. Мысль о принципиальной возможности изменен)ия геномов высших организмов, в том числе и человека, возникла вместе с появлением генетической инженерии. Однако понадобилось около 10 лет, чтобы появились первые животные с экспериментально изменённым геномом. Многие журналы мира в 1982 г. обошла фотография гигантской мыши, выращенной из зародышевой клетки, в которую была введена рекомбинативная ДНК, содержащая постоянно экспрессируемый гормон роста. Этические ограничения не позволяют ставить эксперименты с зародышевыми клетками человека, а потому единственно приемлемым на сегодняшний день представляется введение ДНК в клетки костного мозга in vitro с их последующей трансплантацией в организм человека с целью устранения какого-либо генетического дефекта.

Введение нормальных генов в организм, содержащий дефектные гены, и называют генной терапией. На этом пути уже достигнуты большие успехи. Клетки костного мозга пациента с генетическим дефектом вначале культивируют и потом в них вводят ДНК, содержащий нормальный ген, после чего клетки вновь трансплантируют пациенту. На сегодняшний день техника трансплантации костного мозга достаточно хорошо разработана, разработаны векторы (как правило,на основе ретровирусов), позволяющие экспрессировать различные гены в культуре клеток костного мозга. Более того, в конце 1985 г. три группы исследователей сообщилиоб успешных экспериментах по экспрессии чужеродного гена неомицинтрансферазы в костном мозге мышей in vivo.

В 1986 г. исследователи из Национального института сердца, легкого и крови (США) ввели клетки, экспрессирующие человечески ген аденозиндезаминазы (АДА) в косный мозг обезьян, после чего в нем был обнаружен синтез полноценного человеческого фермента. Количество фермента было в 10 раз меньше необходимого для лечения людей с наследственным недостатком АДА, однако работы по усилению экспрессии продолжаются и есть основания надеяться на их успешное завершение. Можно сказать, что от начала реальной, практически значимой генной терапии нас сегодня отделяют, во-первых, отсутствие высокого уровня экспрессии введенного генетического материала в костном мозге in vivo и, во-вторых, недостаточная уверенность в безопасности ретровирусных векторов, используемые для экспрессии генов в живом организме.

В настоящеевремя наиболее вероятно лечение заболеваний возникших из-за дефектов в единичных генах, заболеваний, в основе которых лежит нехватка какого-либо продукта генной активности. Кроме того, желательно чтобы в норме такой продукт вырабатывался клетками костного мозга. И, наконец, для проведения коррекции генетических дефектов необходимо наличие клонированного нормального гена, дефект которого обусловил развитие болезни. Исходя из этих соображений, наиболее вероятной патологией для генной терапии можно считать острый иммунодефицит, обусловленный недостатком АДА, недостаток нуклеотидфосфорилазы и болезнь Леша—Нойхама, развивающуюся в условиях недостатка или полного отсутствия гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы. На роль кандидатов для генной терапии предложены также цитруллинурия, недостаток транскарбомилазы и, возможно, недостаток α-антитрипсина (Simon К., 1985; Магх J.L., 1986).

Развитие методов генной терапии, несомненно, позволит значительно расширить список болезней, потенциально излечимых сее помощью, а более широкое внедрение методов диагностики наследственных заболеваний с помощью ДНК. ДНК гибридизация создаст надежную основу для уверенного применения генной терапии в медицинской практике будущего.

Возможности генетической инженерии далеко не исчерпаны разработками созданными на сегодняшний день, хотя и они позволяют говорить о новой ступени в развитии медицины. Информация о геноме человека увеличивается с возрастающей скоростью, появляются данные, позволяющие подобраться к генетическим причинам целого ряда патологий даже без знания их биохимических основ. Параллельно идет процесс формирования генной терапии, которая позволит корректировать наследственные патологические изменения на уровне генома. При невозможности такой коррекции способы лечения можно будет искать в естественных регуляторах процессов человеческого организма, получаемых с помощью генно-инженерных продуцентов.

По-видимому, отличительной чертой генетической инженерии применительно к медицине является ее определенность, позволяющая однозначно ставить диагнозы наследственных и инфекционных заболеваний, а в перспективе регулировать физиологические процессы в организме. Генетическая инженерия и медицина — естественный и логичный союз, и у этого союза, бесспорно, большое будущее.

Некоторые продукты генетической инженерии, пригодные

для использования в медицине.