Изготовление препаратов для световой микроскопии

Все препараты, используемые в биологии (в т.ч. цитогенетические) делятся на временные и постоянные. Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску. Фиксация – это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Следовательно, фиксация позволяет сохранить внутриклеточные структуры в неизменном виде на длительное время. Однако при фиксации в клетках могут появляться артефакты – новые структуры, которые отсутствуют в живой клетке, например, разнообразные вакуоли. Для предотвращения появления артефактов необходимо использовать специально подобранные химические растворы – фиксаторы, а сама фиксация должна проводиться в определенных условиях. В частности, желательно использовать охлажденные фиксаторы (до 2...3 ⁰С); для фиксации нужно брать отдельные клетки или кусочки тканей не толще 5 мм; объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 50...100 раз; фиксатор не должен использоваться для длительного хранения материала; фиксатор не должен использоваться повторно. Рассмотрим состав и применение наиболее широко распространенных фиксаторов.

Формалин (формальдегид, или муравьиный альдегид). Наиболее простой и широко распространенный фиксатор. Применяется в виде водных растворов с концентрацией 4...10%, при этом за 100% принимается концентрация продажного формалина. Продажный формалин содержит примесь муравьиной кислоты, которую нейтрализуют с помощью углекислого кальция в течение 24 часов. Время фиксации от 1 часа до 24 часов. Для длительного хранения материал переносят в свежий 10%-ный формалин. Чистый формалин используют в том случае, если планируется дальнейшее изучение локализации и активности ферментов. Чаще же формалин включается в рецептуру более сложных фиксаторов.

Спиртовые фиксаторы. Содержат этиловый или метиловый спирт. Водные растворы спиртов в чистом виде (70%, 96% или 100%) используются относительно редко. Чаще применяют 100%-ные спирты, которые смешивают с другими веществами. В качестве универсальных фиксаторов используют различные композиции на основе формалина, спиртов, органических кислот и неорганических веществ.

Уксусный алкоголь (ацеталкоголь). Это один из наиболее простых фиксаторов. Состоит из 3 частей абсолютного спирта (этилового, а лучше – метилового) и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для приготовления 100%-ного (абсолютного) спирта исходные спирты обезвоживают. Для обезвоживания этилового спирта (этанола) используют безводный сульфат меди, а для обезвоживания метилового спирта (метанола) – оксид кальция. Хранят их в герметичной посуде. Для приготовления ледяной уксусной кислоты исходную концентрированную кислоту охлаждают в холодильнике; при этом кислота замерзает, раньше, чем вода. Жидкость сливают, а замерзшую кислоту оттаивают и используют для приготовления фиксатора. Фиксатор готов для употребления через 24 часа. Хранить фиксатор в темном холодном месте. Время фиксации – 2 – 24 часа. Затем материал переносят в свежий фиксатор, в котором он может храниться до 1 месяца в холодильнике. Для более длительного хранения материал переносят в 70%-ный спирт.

Фиксатор Карнуа. Состав – 1 часть ледяной уксусной кислоты : 6 частей абсолютного спирта : 3 части хлороформа. Это универсальный фиксатор, который обеспечивает быструю фиксацию (в течение 1 – 2 часов).

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту, например, смесь Буэна – 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты: 5 частей формалина: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор готовят непосредственно перед употреблением. Время фиксации от 1 до 24 часов (иногда несколько суток). Фиксированный материал хранят в 70%-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие сулему (хлорид ртути (II) – HgCl₂). Сулема используется в виде насыщенного водного раствора в смеси с ледяной уксусной кислотой (25 : 1), формалином (8,5 : 1) и более сложных композиций (фиксатор «Суза», фиксатор Ценкера и др.). Время фиксации от 1 до 24 часов. Затем сулему удаляют спиртовым раствором йода (6 частей 70%-ного спирта : 1 часть йодной настойки), а йод удаляют 70%-ным спиртом. Фиксированный материал хранят в 70%-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие осмий (четырехокись осмия, или осмиевая кислота). Дают наилучшие результаты, используются при изготовлении препаратов как для световой, так и электронной микроскопии. Можно использовать 1...2%-ный раствор осмиевой кислоты, но чаще применяют композиции, например, фиксатор Флемминга – 15 частей 2%-ной осмиевой кислоты : 1 часть ледяной уксусной кислоты. Фиксация протекает медленно (от 24 часов до нескольких суток).

Кроме перечисленных фиксаторов общего назначения, существуют и специальные фиксаторы. Например, фиксатор для митохондрий содержит 4 части 3%-ного раствора дихромата калия и 1 часть 40%-ного формалина. Фиксатор для хлоропластов содержит 15 частей насыщенного раствора медного купороса, 1 часть 40%-ного формалина и 5 частей воды.

В ряде случаев вместо химической фиксации применяется быстрое замораживание образцов, например, при температуре жидкого азота (–196⁰С) или при температуре сухого льда (–78⁰С). Замороженные объекты могут быть обезвожены путем возгонки воды в вакууме при температуре ниже –40⁰С (этот процесс называется лиофилизация).

Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители – это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки.

Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток. Названия красителей могут соответствовать получаемой окраске (рубин, кармин, метиловый синий, метиленовый синий, генциановый фиолетовый, метиловый зеленый, оранжевый золотой). Иногда русские названия цветов заменяют на немецкие, например: метилблау, генцианвиолет. В других случаях названия носят отвлеченный, исторически сложившийся характер, например: пиронин, фуксин, сафранин, флороглюцин, судан III. Иногда название красителя не соответствует полученной окраске, например, синий тионин дает фиолетово-красное окрашивание. Довольно редко применяются химические номенклатурные названия красителей, например: диметиламинобензальдегид, 8-амино-1-нафтол-5-сульфокислота. Различают основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры (то есть структуры с кислотными свойствами). Кислотные красители избирательно окрашивают ацидофильные, или оксифильные клеточные структуры (то есть структуры со щелочными свойствами). Нейтральные красители окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры. Наименее токсичные красители используются для прижизненной окраски клеток. Эти красители обычно применяют в виде водных растворов, например: метиленовый синий (концентрация от 1 : 1000 до 1 : 10000), трипановый синий (0,5%-ный р-р), нейтральный красный (от 1 : 50000 до 1 : 200000). Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, концентрация от 0,1% до 1%), например: эозин, фуксин. Часто используют смеси красителей, например, смесь Романовского–Гимза (содержит метилен–азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин), окраска по Маллори (последовательное использование кислотного фуксина S, а затем смеси анилинового синего и оранжевого золотого G), азур–эозин, метилблау–эозин.

Некоторые красители образуются в ходе их приготовления. Например, широко известное вещество растительного происхождения гематоксилин становится красителем только после его окисления до гематеина. Для окрашивания ядер и хромосом широко используются красители в сочетании с органическими кислотами.

Методики приготовления некоторых наиболее простых красителей.

Приготовление 2%-ного ацетофуксина. 1 грамм основного фуксина растворяют в 50 мл 40%-ной уксусной кислоты при подогревании на водяной бане.

Приготовление 1%-ного ацеторсеина. К 1 грамму орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и настаивают около 12 часов. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды. После чего нагревают до кипения и охлаждают, повторяя эту процедуру 10 раз. Через сутки краситель фильтруют. Перед окрашиванием на 9 частей красителя добавляют 1 часть 1 N раствора HCl.

Приготовление 4%-ного ацетокармина. Раствор готовят в термостойкой колбе с водяным холодильником. 4 грамма ацетокармина смешивают с 100 мл 50%-ной уксусной кислоты и кипятят 1 час. Через сутки краситель фильтруют. Аналогичным образом приготавливается ацетолакмоид. Вместо уксусной кислоты часто используют другие органические кислоты, например, 40%-ную молочную кислоту.

Все красители после приготовления фильтруют и хранят в темном прохладном месте. Время окрашивания препаратов зависит от температуры (обычно от 20 минут до 1 суток). При нагревании или кипячении время окрашивания сокращается.

Кроме окрашивания органическими красителями отдельные структуры можно выделить, используя их импрегнацию серебром и другими металлами.

Приготовление постоянных микротомных препаратов. Постоянные препараты готовятся по специальным методикам, обеспечивающим их хранение в течение десятков лет. К постоянным препаратам относятся мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, культур микроорганизмов, изолированных тканевых клеток. Тотальные препараты представляют собой отдельные прозрачные и тонкие объекты. Однако в большинстве случаев для изготовления препаратов используются достаточно толстые образцы тканей, которые служат для изготовления срезов.

Учебные срезы можно сделать вручную, с помощью бритвы. Однако качественные срезы с заданной толщиной 10 – 22 мкм обычно изготавливают с помощью специальных приборов – микротомов.

Рис.4. Современный микротом (фирма Leica).

Такие срезы часто называют микротомными препаратами. Для получения более тонких срезов (0,01...0,05 мкм, или 10...50 нанометров) используют ультрамикротомы.

Кратко рассмотрим основные этапы приготовления микротомных препаратов.

1. Фиксация материала. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Количество смен промывных жидкостей – не менее 3. Время – до 24 часов.

2. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка. После водных фиксаторов используется 8 смен спирта: 20%, 40%, 80%, две смены по 96%, две смены по 100%. После спиртовых фиксаторов – 4 смены спирта : две смены по 96% и две смены по 100%. В каждой смене материал выдерживается по 1 часу.

3. Просветление. Пропитывание материала растворителем парафина – ксилолом (бензолом, хлороформом). Образец помещается на 1 час последовательно в каждый из последующих растворов: 3 части спирта + 1 часть ксилола, затем 2 части спирта + 2 части ксилола, затем 1 часть спирта + 3 части ксилола, затем две смены ксилола.

4. Заливка в парафин. Замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57⁰С и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). Затем при температуре 55...57⁰С производится проводка через парафин I (6...12 часов), парафин II (6...12 часов) и заливка в парафин III. Парафины I, II, III отличаются только чистотой: парафин III – это окончательная среда, которая должна обладать наибольшей чистотой. В итоге получаются парафиновые блоки, в которых заключены образцы материала. Эти блоки можно резать в любом направлении.

5. Окрашивание срезов. Парафиновые срезы наклеивают на чистое предметное стекло. В качестве клея можно использовать смесь белка куриного яйца с глицерином (в соотношении 1 : 2) с добавлением антисептика (тимола или фенола). Обычно производят депарафинирование срезов. Для этого стекла с наклеенными срезами проводят через ксилол, спирты убывающей концентрации (100%, 96%, 80%, 70%) и дистиллированную воду. Время нахождения в каждой среде – 2...3 минуты. Далее окрашивают согласно методикам.

6. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов. Выполняется путем проводки через спирты возрастающей концентрации, а затем через ксилол.

7. Заключение в среды (заливка). Для длительного хранения препаратов их необходимо заключить в среду, предохраняющую препарат от окисления воздухом и от поражения грибками. Для заливки используются специальные смолы (канадский бальзам, пихтовый бальзам), которые растворяют в ксилоле до консистенции жидкого меда. Каплю такого раствора наносят на срез и покрывают покровным стеклом.

Для ускоренного приготовления препаратов обезвоживание окрашенных срезов не производят, а для заливки используют глицерин–желатину. Для приготовления этой среды 15 г чистого (белого) желатина растворяют в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, добавляют 100 г глицерина и 2 капли фенола.

В ряде случаев для приготовления срезов используются замораживающие микротомы. Замораживающей жидкостью служит жидкая углекислота. На замораживающем микротоме можно резать фиксированный и нефиксированный материал. Достоинство замораживающих микротомов в том, что не требуется длительной проводки образцов через различные среды.