Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 — сканирующий столик; 2 — исследуемый образец; 3, 7 — объективы; 4 — сканирующее устройство; 5 — светоделительная пластина; 6 — луч света от лазера; 8, 12 — изображение точек В и С; 9 — игольчатая диафрагма; 10 — изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 — приемник излучения; 13, 15 — свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 — свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r_A= XY =0,6 λ/NA,

где r_A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n^-2,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n^-4. Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY^c_r =0,4 λ/NA,

где XY^c_r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z_r=2 λ/NA²,

где Z_r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z_r^c=1,4 λ/NA²,

где Z_r^c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество — возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z_1/2= 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n_i.

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z_1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са²⁺, мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.