D-конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Конфокальная микроскопия является неразрушающим методом получения двумерных оптических сечений материала, позволяющим изучать пространственную (3D) топологию поверхности или внутреннюю (подповерхностную) структуру полупрозрачных образцов. Конфокальная микроскопия изучает поверхности размером от 5 до 200 мкм с высоким разрешением (± 0,2 мкм), а также особенности, находящиеся на глубине до нескольких миллиметров под поверхностью образца с несколько меньшим разрешением. Максимальная глубина определяется предельным рабочим расстоянием объектива, то есть расстоянием от поверхности объектива до находящегося в фокусе объекта. Эта величина близка к фокусному расстоянию объектива.

В 1957 году Марвин Минский (рис. 14, а) из Гарвардского университета запатентовал «сканирующий микроскоп с двойной фокусировкой». Так он основал конфокальную микроскопию, позволяющую сегодня изучать 3D-структуру образцов методом последовательных оптических сечений. Рис. 14, b демонстрирует схему первого микроскопа Минского с «двойной фокусировкой», в которой свет лампы проходит через тонкое отверстие и фокусируется конденсором на образец. Свет, прошедший через образец, фокусируется объективом через второе микроотверстие на детектор. Объектив и конденсор конфокальны, то есть имеют одну точку фокуса, что и обусловило название «конфокальная микроскопия». Изучение лучевой диаграммы показывает, что свет любой точки, не совпадающей с точкой фокуса обеих линз, не попадает на детектор. Конфокальный микроскоп позволяет получить оптическое изображение одной точки в объёме прозрачного объекта, не несущее информации об окружающих внефокусных областях. Конфокальные изображения называют оптическими сечениями. Они позволяют изучить 3D-структуру материала без реального разрезания образца. Эту способность иллюстрирует рис. 15, на котором приведены оптические сечения цветочной пыльцы. Получение такой информации при помощи обычного микроскопа потребовало бы микротомирования образца на большое количество тонких срезов.

Схема конфокального микроскопа отражённого света представлена на рис. 14, c. В нём объектив используется и как конденсор, и как объектив. Теперь это является классической схемой конфокального микроскопа. Эта конструкция также имеет два микроотверстия, один перед источником света, а второй перед детектором. Чем меньше отверстие, тем меньше рассеянного света попадает на детектор и тем меньше объём элементарной точки, создающей изображение.

В патенте Минского описан яркий источник белого света, но теперь в конфокальных микроскопах используют лазер. Поэтому их называют конфокальными сканирующими лазерными микроскопами (КСЛМ). При использовании лазерного источника света осветительное отверстие (отмеченное буквой А на рис. 14, c) не требуется, что упрощает схему.

Обе схемы на рис. 14 обеспечивают конфокальное изображение одной точки образца. Чтобы получить двумерное изображение, нужно найти способ перемещения точки фокуса, то есть обеспечить сканирование образца. В первой системе Минского сканирование осуществляли физическим перемещением образца, расположенного на предметном столике. Увеличение в этом случае полностью определяется размером сканируемой области, вследствие чего увеличение и размер поля зрения оказываются не связанными. Это можно использовать для увеличения размера поля зрения, которое может достигать сантиметров, что значительно превосходит максимальный размер поля зрения стандартных объективов. Основным недостатком всех сканирующих микроскопов является большое время построения изображения.

В самых современных конфокальных микроскопах в качестве источника света используют лазер, создающий сфокусированное пятно света в объёме образца. Изображение получают сканированием пятна света по образцу, как показано на рис. 16. Отражённый от образца свет с помощью той же оптики фокусируют через микроотверстие на детектор. Скорость получения изображения определяется скоростью движения устройства, разворачивающего лазерный луч. В коммерческих микроскопах в качестве сканирующего устройства наиболее широко используют зеркала с гальванометрическим управлением, позволяющие строить от одного до трёх кадров в секунду.

В настоящее время настройка прибора может полностью контролироваться компьютером. Задачей разработчика программного обеспечения является «освобождение микроскописта от необходимости принятия решений». Другими словами, программа на основании оценки качества изображения должна сама настраивать прибор.